一种具备双单链末端PCR产物的获得方法及其检测方法技术
【技术实现步骤摘要】
一种具备双单链末端PCR产物的获得方法及其检测方法
本专利技术属于核酸
，具体涉及一种具备双单链末端PCR产物的获得方法及其检测方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR技术通过将模板核酸在高温(95℃)时变性成单链，在降温后(降至50℃-60℃)引物与模板根据碱基互补配对特异性结合；在最适延伸反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶以5'-3'的方向合成互补链的反应。整个反应由高温变性、低温退火及适温延伸组成的循环反应进行。一个循环需2～4分钟，2～3小时使目的DNA得以迅速扩增，将待扩目的基因扩增放大几百万倍。因PCR技术特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点而被广泛应用。不仅常被用于核酸的基础研究，PCR技术也是目前核酸检测的金标准，在医学、生物工程等领域应用广泛。PCR产物是具有平末端的双链DNA，一般包括通过琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行分离，随后需要借助染色和紫外透射成像进行分析。上述操作步骤繁琐、耗时长，且依赖仪器及特殊训练的专业人员，不适用于高通量、...
【技术保护点】
一种具备双单链末端PCR产物的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计用于扩增目的核酸的正向引物F和反向引物R序列，并在正向引物F和反向引物R序列的5'端分别加上Tag1和Tag2序列，Tag1序列和正向引物F之间、Tag2序列和反向引物R之间分别用若干胸腺嘧啶隔开，合成引物Tag1‑F和Tag2‑R；(2)用紫外线对引物溶液Tag1‑F和Tag2‑R照射至少30min；(3)混合PCR反应体系置于PCR仪中进行反应，得到具备双单链末端的PCR产物。
【技术特征摘要】
2016.10.19 CN 20161090872261.一种具备双单链末端PCR产物的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计用于扩增目的核酸的正向引物F和反向引物R序列，并在正向引物F和反向引物R序列的5'端分别加上Tag1和Tag2序列，Tag1序列和正向引物F之间、Tag2序列和反向引物R之间分别用若干胸腺嘧啶隔开，合成引物Tag1-F和Tag2-R；(2)用紫外线对引物溶液Tag1-F和Tag2-R照射至少30min；(3)混合PCR反应体系置于PCR仪中进行反应，得到具备双单链末端的PCR产物。2.根据权利要求1所述的具备双单链末端PCR产物的获得方法，其特征在于，步骤(1)中若干胸腺嘧啶的两端分别各加一个腺嘌呤或胞嘧啶。3.根据权利要求1所述的具备双单链末端PCR产物的获得方法，其特征在于，步骤(1)中胸腺嘧啶的数量为6-10个。4.根据权利要求1或2或3所述的具备双单链末端PCR产物的获得方法，其特征在于，Tag1和Tag2序列分别为：Tag1：5’-CTGTACGAGACT-3’Tag2：5’-TCTAATGCTGAT-3’。5.根据权利要求1或2或3所述的具备双单链末端PCR产物的获得方法，其特征在于，步骤(2)中紫外线优选波长100～290nm。6.权利要求1-5任一所述具备双单链末端PCR产物的检测方法，其特征在于，可选择以下两种方法中的任一种：(一)直接法：分别设计并合成与Tag1和Tag2互补的序列C-Tag1和C-Tag2，并分别在C-Tag1和C-Tag2的3'端用巯基修饰；将修饰过后的C-Tag1和C-Tag2分别通过金硫键结合到胶体金粒子上，得到AuNPDNA1和AuNPDNA2；将AuNPDNA1和AuNPDNA2按C-Tag1和C-Tag2摩尔比0.8-1.2:0.8-1.2混匀制备成红色透明的标记胶体金溶液；将PCR产物加入到标记胶体金溶液中混匀，肉眼观察进行检测及判断，标记胶体金溶液无变化则检测结果为阴性，标记胶体金溶液变浑浊则检测结果为阳性；(二)试纸条法：分别设计并合成与Tag1和Tag2互补的序列C-Tag1和C-Tag2，C-Tag1的3'端用巯基修饰，合成Tag1序列；将修饰后的C-Tag1通过金硫键结合到胶体金粒子上，得到AuNPDNA1，并将AuNPDNA1喷在胶体金试纸条的金标垫上；将C-Tag2序列固定在试...
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