一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种生物样本保存技术领域，具体涉及一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法。本发明专利技术方法包括：a、样品采集：采集排便时间＜12h的大熊猫粪便；b、样品预处理：将采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中22～26h；c、样品保存：取浸泡后的粪便样品，干燥，转入底部铺满硅胶珠的离心管中，加入无菌脱脂棉，排尽瓶中空气。本发明专利技术大熊猫粪便中DNA的保存方法保存时效长、保存效果佳、便于携带和运输，由大熊猫线粒体DNA的扩增结果可知，大熊猫粪便DNA用乙醇‑干燥法保存6个月和12个月，扩增成功率均为100%；保存24个月，扩增成功率仍然达到90%以上，可以用于大熊猫野外数量的调查、遗传多样性分析等保护遗传学研究的前期工作中。

A method for long-term and efficient preservation of DNA in giant panda faeces

The invention relates to the technical field of biological sample preservation, in particular to a method for preserving the DNA in the faeces of giant panda for a long time and high efficiency. The method includes: A, sample collection: collecting the defecation time less than 12h panda feces; B, sample pretreatment: the collected faeces of the giant panda's surface removal, immersed in ethanol is 22 ~ 26h; C and sample: after soaking fecal samples into centrifugal drying, bottom covered with silica gel bead tube, add sterile cotton, exhausting the air in the bottle. Preservation method of the present invention the faeces of the giant panda DNA save long time, preservation effect is good, easy to carry and transport, the giant panda mitochondrial DNA amplification results showed that the panda feces DNA with ethanol drying for 6 months and 12 months, amplification success rates were 100%; 24 months storage expansion the success rate is still above 90%, can be used for the giant panda population survey, genetic diversity analysis and other preparatory work in conservation genetics.

【技术实现步骤摘要】
一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法
本专利技术涉及一种生物样本保存
，具体涉及一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法。
技术介绍
大熊猫是我国的濒危野生动物，在大熊猫的保护遗传学研究中，学者需要通过评估大熊猫的遗传多样性来提出相应的保护建议，而样品采集是学者获得遗传学数据的基础。由于大熊猫粪便样品的资源丰富、易获得，且不干扰大熊猫的活动、对其造成伤害，加上DNA提取技术的进步，粪便DNA已成为学者获得野外动物遗传学数据较为广泛和可行的取样方法。尽管粪便样品有以上的优点，但是粪便DNA存在浓度和质量低下、易降解、含有PCR抑制剂等问题，往往造成PCR扩增成功失败（TendeT,HanssonB,OttossonUetal:EvaluatingpreservationmediumforthestorageofDNAinAfricanlionPantheraleofaecalsamples.CurrentZoology2014,60(3):351-358.；ReddyPA,BhavanishankarM,BhagavatulaJetal:ImprovedMethodsofCarnivoreFaecalSamplePreservation,DNAExtractionandQuantificationforAccurateGenotypingofWildTigers.PlosOne2012,7(10).），进而导致遗传学结论的不可靠性，同时降低了藉此提出的管理或者保护建议的可信度。研究证实，有效的粪便保存方法可以提高PCR扩增成功率（TendeT,HanssonB,OttossonUetal:EvaluatingpreservationmediumforthestorageofDNAinAfricanlionPantheraleofaecalsamples.CurrentZoology2014,60(3):351-358.）。关于大熊猫粪便样品的保存方法报道的仅有甲醛和乙醇、-20℃冷冻法（方盛国,冯文和,张安居等.佛坪三官庙地区大熊猫种群数量的DNA指纹分析.应用与环境生物学报1996,2(3):289-293.；张保卫,魏辅问,李明等.大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法.动物学报50（3）：452-458）。由于甲醛毒性较大且保存效果不佳，近年来已不被使用；乙醇虽然无毒且保存效果好，但乙醇容易泄露，在航空运输中禁止携带，不便于运输；-20℃冷冻法由于需要反复冻融DNA，长期保存效果不佳。尽管其他物种的最佳粪便DNA保存方法已有报道，但粪便DNA保存方法的效果随着物种、生存环境的不同而不同。因此，我们仍然需要专利技术一种适用于大熊猫的长期保存效果佳、方便运输的粪便保存方法，这对于大熊猫的保护遗传学研究来说具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种长期高效保存大熊猫粪便中DNA的方法。本专利技术一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，包括以下步骤：a、样品采集：采集排便时间＜12h的大熊猫粪便；b、样品预处理：将a步骤采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中22～26h；c、样品保存：取出b步骤浸泡后的粪便样品，干燥，转入底部铺满硅胶珠的离心管中，排尽瓶中空气。进一步的，上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中b步骤中采用无菌镊子将a步骤采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中24h。上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中c步骤中所述干燥温度为60～70℃，干燥时间为1.5～2.5h。进一步的，上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中c步骤中所述干燥温度为65℃，干燥时间为2h。上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中c步骤中采用脱脂棉排尽瓶中空气。进一步的，上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中所述样品保存之后还包括DNA提取及检测步骤。进一步的，上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中所述DNA提取及检测步骤具体包括以下步骤：Ⅰ、DNA提取：样品分别保存6个月、12个月、24个月后，用酚-氯仿抽提法提取大熊猫粪便的DNA；Ⅱ、引物合成：采用PAGE纯化法合成引物，引物的上游序列为ptp:5’CTCCCTAAGACTCAAGGAAG3’；下游序列为p12s:5’TAGGAAGGCTAGGACCAAACC3’；Ⅲ、PCR扩增：将步骤Ⅰ提取的DNA样品用合成的引物进行扩增；Ⅳ、线粒体的10uLPCR扩增体系：1μL含Mg2+的10xBuffer，0.8μL2.5mM的dNTP，0.4μL10mM的上游引物，0.4μL10mM的下游引物，0.1μLBSA,0.1μL5U/μL的rTaq酶，1μL基因组DNA，6.2μL灭菌超纯水；Ⅴ、PCR扩增条件：95℃总变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共35个循环；最后72℃总延伸5分钟；Ⅵ、扩增结果检测：扩增产物用1.5%的琼脂糖进行电泳检测；统计扩增成功样品，计算扩增成功率。进一步的，上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中Ⅳ步骤中所述基因组DNA采用无菌超纯水、按照体积比1:10进行稀释。本专利技术方法称为乙醇-干燥法，大致包括两大步，第一步将大熊猫粪便样品表层用无菌镊子剥去，放入试剂瓶中，加入能够完全覆盖粪便样品的无水乙醇保存24小时左右；第二步，倒掉无水乙醇，将样品转入50mL离心管，放入65℃烘箱中干燥2小时，再转入底部含有硅胶珠的50mL离心管中（硅胶珠的体积约为粪便样品的三分之一），加入脱脂棉排除多余的空气后在室温下进行保存。保存过程中，定期查看硅胶珠的吸水性，如果硅胶珠由蓝色变为粉色，说明硅胶珠吸有水分，需要更换硅胶珠。对上述保存方法的效果进行如下检测：上述样品在室温下分别保存6个月、12个月、24个月，在不同的时间节点，取3g大熊猫粪便进行酚—氯仿法提取DNA，再采用已发表的线粒体引物（上游ptp:5’CTCCCTAAGACTCAAGGAAG3’，下游p12s:5’TAGGAAGGCTAGGACCAAACC3’）对DNA模板进行10ulPCR体系特定条件下的扩增。线粒体的10ulPCR体系：1μL含Mg2+的10xBuffer，0.8μL2.5mM的dNTP，0.4μL10mM的上游引物，0.4μL10mM的下游引物，0.1μLBSA，0.1μL5U/μL的rTaq酶，1μL基因组DNA(1:10稀释)，6.2μL灭菌超纯水。线粒体的扩增条件：95℃总变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共35个循环，最后72℃总延伸5分钟。取PCR产物5μL进行琼脂糖电泳检测。本专利技术大熊猫粪便中DNA的保存方法简单、高效，既利用了乙醇迅速脱水的特点，采用烘箱干燥和硅胶珠干燥除去液体，还改善了乙醇不易携带运输的缺点。而且本专利技术方法保存时效长、保存效果佳、便于携带和运输，对大熊猫线粒体DNA的扩增结果可知，大熊猫粪便DNA用乙醇干燥法保存6个月和12个月，扩增成功率均为100%；保存24个月，扩增成功率仍然达到90%以上，可以用于大熊猫野外数量的调查、遗传多样性分析等保护遗传学研本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、样品采集：采集排便时间＜12h的大熊猫粪便；b、样品预处理：将a步骤采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中22～26h；c、样品保存：取出b步骤浸泡后的粪便样品，干燥，转入底部铺满硅胶珠的离心管中，排尽瓶中空气。

【技术特征摘要】
1.一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、样品采集：采集排便时间＜12h的大熊猫粪便；b、样品预处理：将a步骤采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中22～26h；c、样品保存：取出b步骤浸泡后的粪便样品，干燥，转入底部铺满硅胶珠的离心管中，排尽瓶中空气。2.根据权利要求1所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，b步骤中采用无菌镊子将a步骤采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中24h。3.根据权利要求1所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，c步骤中所述干燥温度为60～70℃，干燥时间为1.5～2.5h。4.根据权利要求3所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，c步骤中所述干燥温度为65℃，干燥时间为2h。5.根据权利要求1所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，c步骤中采用脱脂棉排尽瓶中空气。6.根据权利要求1所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征在于，所述样品保存之后还包括DNA提取及检测步骤。7.根据权利要求6所述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张和民，李德生，黄炎，
申请(专利权)人：中国大熊猫保护研究中心，四川省自然资源科学研究院，
类型：发明
国别省市：四川,51