本发明专利技术涉及用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒，该质粒由PGEM-T?easy载体和串联在一起的PA基因、capA基因、rpoB基因组成，记为PGEM-T-easy-RCP；还涉及包括上述重组标准质粒的试剂盒；还涉及上述重组标准质粒的构建方法，包括以下步骤：设计引物对、扩增序列、构建第一中间质粒、构建第二中间质粒、构建重组标准质粒。本发明专利技术的重组标准质粒PGEM-T-easy-RCP可作为炭疽杆菌阳性标准品(即炭疽杆菌强毒株核酸)的替代品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于检测病原微生物的重组标准质粒、试剂盒及该质粒的构建方法，尤其是一种，属于生物工程
技术介绍
炭疽杆菌能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病，其中肺炭疽已被列为中国国家法定甲类传染病(最高级别)。炭疽杆菌可通过空气飞沫传播，可形成气溶胶，易引发突发公共卫生事件，严重威胁公众财产、健康和生命安全。快速有效的病原检测技术在炭疽疫情的预防、控制及应急反应决策中起着极其关键的作用，对保障公众的生命财产安全具有重要意义。目前的检测方法有两类一类主要基于对病原体的培养、染色镜检、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些方法均不适合早期快速侦检，难以适应疫情控制的需要；另一类为基于核酸诊断的常规PCR(聚合酶链式反应) 检测技术和实时荧光PCR检测技术，因其具有高灵敏度和特异性强、快速的优点，已成为目前最重要、应用最广泛的两种核酸检测诊断技术。采用上述核酸检测诊断技术检测炭疽杆菌时，需要用炭疽杆菌阳性标准品作为对照品，比如用该标准品设置阳性对照来监控检测过程，再如实时荧光定量检测中需要用含量准确的该标准品来制作标准曲线。然而，由于烈性病原微生物生物安全的限制，人们很难获得炭疽杆菌阳性标准品(即炭疽杆菌强毒株核酸)，这已成为建立和应用核酸检测方法的瓶颈。目前已经出现了采用前述核酸检测诊断技术检测炭疽杆菌的试剂盒，但这些试剂盒采用的对照品并不是上述的炭疽杆菌阳性标准品，而是针对炭疽杆菌中的某一靶基因进行克隆得到的质粒，或者是仅克隆某一靶基因的一部分序列的质粒；不同的试剂盒采用的对照品质粒针对不同的靶基因、或针对同一靶基因的不同序列部分，而且这些对照品质粒的序列均是保密的；不同试剂盒的测算方法也各不相同。这就导致各试剂盒的对照品质粒很难通用于其它试剂盒，难以客观比较各试剂盒的检测性能(如检测灵敏度等)，使人很难选出符合自己需求的试剂盒。因此，本领域技术人员非常迫切地需要一种能通用于各试剂盒、且能代替炭疽杆菌阳性标准品的无致病性对照品。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是针对现有技术存在的问题，提供一种用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒，该质粒可作为炭疽杆菌阳性标准品的替代品，可通用于现有的各种采用核酸检测诊断技术检测炭疽杆菌的试剂盒。本专利技术的第二目的是提供前述用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒的构建方法。本专利技术的第三目的是提供含有前述用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒的试剂实现本专利技术第一目的的技术方案如下一种用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒， 其特征是，由PGEM-T easy载体和串联在一起的PA基因、capA基因、rpoB基因组成，记为 PGEM-T-easy-RCP ；其中，所述PA基因序列如SEQ. ID. No. 1所示，所述capA基因序列如SEQ. ID. No. 2所示，所述rpoB基因序列如SEQ. ID. No. 3所示。进一步地，所述PA基因的5’端经&il I限制酶酶切位点与PGEM-T easy载体连接， 所述PA基因的3’端经HindIII限制酶酶切位点与所述capA基因的5’端连接；所述capA 基因的3’端经Nhe I限制酶酶切位点与rpoB基因的5’端连接；所述rpoB基因的3’端经 SacI限制酶酶切位点与PGEM-T easy载体连接；其中，所述HindIII限制酶酶切位点序列如 SEQ. ID. No. 4所示；所述Sal I限制酶酶切位点序列如SEQ. ID. No. 5所示；所述Nhe I限制酶酶切位点序列如SEQ. ID. No. 6所示；所述Me I限制酶酶切位点序列如SEQ. ID. No. 7所示；由所述Ml I限制酶酶切位点、所述PA基因、所述HindIII限制酶酶切位点、所述capA 基因、所述Nhe I限制酶酶切位点、所述rpoB基因、所述Mc I限制酶酶切位点串联而成的序列如SEQ. ID. No. 8所示。其中，PA基因指炭疽杆菌PXO1质粒的保护性抗原基因，capA基因指炭疽杆菌PX02 质粒的荚膜合成相关基因A，rpoB基因指炭疽杆菌染色体的RNA聚合酶ρ亚单位基因。本专利技术的重组标准质粒具有串联克隆的全长序列的PA基因、capA基因和rpoB 基因，不仅可用于区分炭疽杆菌强毒株、弱毒株、无毒株的检测方法和检测试剂盒(在炭疽杆菌中，当PA基因与capA基因并存时为强毒株，只有其中之一为弱毒株，都没有则为无毒株)，还可用于检测炭疽杆菌主基因组、或检测重组基因型炭疽杆菌，具有普遍适用性，能兼容目前绝大部分炭疽杆菌核酸检测技术(如炭疽杆菌特异性定性/定量PCR检测技术，炭疽杆菌多重PCR检测技术等)，仅需一次制备即可获得各检测技术所需的对照品。本专利技术的重组标准质粒可代替炭疽杆菌阳性标准品，作为本领域技术人员客观比较各种试剂盒检测性能的标准物，为选择合适的试剂盒提供便利。实验证明，本专利技术重组标准质粒具有特异性好、灵敏度高等优点，进行样品定量分析时，检测结果偏差符合国际标准。实现本专利技术第二目的的技术方案如下一种用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒的构建方法，其特征是，包括以下步骤(1)设计引物对针对PA基因序列设计引物对pa-F和pa_R ；针对capA基因序列设计引物对capa-F和capa_R ；针对rpoB基因序列设计引物对rpob_F和rpob_R ；所述PA基因序列如SEQ. ID. No. 1所示，所述capA基因序列如SEQ. ID. No. 2所示， 所述rpoB基因序列如SEQ. ID. No. 3所示；所述pa_F的序列如SEQ. ID. No. 9所示，所述pa_R 的序列如SEQ. ID. No. 10所示，所述capa-F的序列如SEQ. ID. No. 11所示，所述capa-R的序列如SEQ. ID. No. 12所示，所述rpob-F的序列如SEQ. ID. No. 13所示，所述rpob-R的序列如 SEQ. ID. No. 14 所示；(2)扩增序列以炭疽杆菌强毒株总DNA为模板，分别用第(1)步的各引物对进行 PCR扩增，获得PA基因扩增产物、capA基因扩增产物、rpoB基因扩增产物，回收后备用；(3)构建第一中间质粒用Ml I和Mc I分别双酶切备用的capA基因扩增产物、 PGEM-T easy载体，然后用DNA连接酶连接，得到第一中间质粒；所述第一中间质粒转化氨苄敏感性菌株，在含氨苄青霉素的培养基平板上获得重组菌落，并利用菌落PCR技术和DNA 测序技术进行鉴定；回收第一中间质粒，备用；(4)构建第二中间质粒用Sal I和HindIII分别双酶切备用的第一中间质粒和备用的PA基因扩增产物，然后用DNA连接酶连接，得到第二中间质粒；所述第二中间质粒转化氨苄敏感性菌株，在含氨苄青霉素的培养基平板上获得重组菌落，并利用菌落PCR技术和DNA测序技术进行鉴定；回收第二中间质粒，备用；(5)构建重组标准质粒用Nhe I和Mc I分别双酶切备用的第二中间质粒和备用的rpoB基因扩增产物，然后用DNA连接酶连接，得到重组标准质粒；所述重组标准质粒转化氨苄敏感性菌株，在含氨苄青霉素的培养基平板上获得重组菌落，并利用菌落PCR技术和DNA测序技术进行鉴定；回收重组标准质粒，备用。本专利技术还提供另一种用于检测炭疽杆菌的重组标准质本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒，其特征是，由ＰＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载体和串联在一起的ＰＡ基因、ｃａｐＡ基因、ｒｐｏＢ基因组成，记为ＰＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ－ＲＣＰ；其中，所述ＰＡ基因序列如ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１所示，所述ｃａｐＡ基因序列如ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２所示，所述ｒｐｏＢ基因序列如ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张锦海，王忠灿，王长军，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区军事医学研究所，
类型：发明
国别省市：84
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