一种引物组合物及用于融合基因检测的试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种引物组合物及用于融合基因检测的试剂，能基于多重PCR方法检测人类肺癌融合基因，其引物组合物可通过如SEQ ID NO 1～54所示的序列特异性地扩增RNA样本中ALK、NRG、NTRK1、RET、ROS1等5种融合驱动基因的至少50种融合突变形式，以及作为样本质控的看家基因。该反应既可在一管中进行，也可分拆为多管进行。多管反应时，可加入修饰有荧光基团、如SEQ ID NO 55～70所示序列的特异性探针组合物形成qPCR试剂。使用该qPCR试剂检测阳性样本时，可报告低至0.04ng RNA中的融合基因。本发明专利技术流程简单高效，易操作，成本低，具有良好的前景。

【技术实现步骤摘要】
一种引物组合物及用于融合基因检测的试剂
本专利技术涉及基因检测
，特别是涉及一种引物组合物及用于融合基因检测的试剂。
技术介绍
肿瘤发生时，经常会发生基因组水平的断裂和重新拼接。当两个基因分别断成两半，并且发生了错误的相互拼接时，就有可能形成新的基因，即称为融合基因。致癌的融合基因转录为mRNA时，其结构可分为明显的两部分：3’端通常来自具有激酶活性，原本刺激细胞生长、增殖的基因，如ALK、RET等，这些基因称为融合基因突变的“驱动基因”；5’端的序列来源则比较多样，其来源基因又称为融合基因突变的“伙伴基因”，这些序列的共同特点是在肿瘤细胞中具有较高且不易受调控的表达，导致细胞中刺激生长的激酶活性过高，下游调控通路持续激活，最终导致癌变。研究表明，肺癌中约10％是由融合基因突变导致，其中最常见的是ALK融合，其次为ROS1融合，其他还包括RET融合、NTRK融合、NRG融合等。市场上已有色瑞替尼、克唑替尼、恩曲替尼等专门针对融合基因突变的靶向药物问世。NCCN指南、CSCO指南也明确指出建议对肺癌患者进行ALK融合和ROS1融合的检测，相关的检测市场十分巨大。目前融合基因检测的方法主要有FISH(荧光原位杂交)、IHC(免疫组化)、qPCR(荧光定量PCR)、NGS(二代测序)等。FISH是当前融合检测的金标准，但本身灵敏度较低(10-15％)，操作耗时长且复杂，同时依赖于人工判断。IHC优点在于价格较低，但判定标准更加主观，且无法直接检测融合基因片段。qPCR灵敏度较高(1-5％)，可操作性强，价格也较低，缺点在于一般一次只能检测一种或近似的数种已知融合突变。NGS的灵敏度稍差于qPCR，设计合理的情况下一次可测的融合突变类型也较多，但仍然存在着耗时较长、检测成本较高的问题。总而言之，目前现存的检测方法都存在一定的局限性，有待继续改进。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种引物组合物及用于融合基因检测的试剂，能基于多重PCR方法检测人类肺癌融合基因。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种引物组合物，所述引物组合物中的引物包括SEQIDNO.1～52所示的序列中的部分或全部，可特异性地扩增融合基因片段。在本专利技术一个较佳实施例中，所述引物包括序列中的部分或全部：所述序列选取SEQIDNO.1～52所示的序列中每条序列其中的18-25个碱基，可特异性地扩增融合基因片段。在本专利技术一个较佳实施例中，所述引物组合物中的引物还包括SEQIDNO.53～54所示的序列，可特异性地扩增看家基因片段。在本专利技术一个较佳实施例中，所述引物包括SEQIDNO.53～54所示的序列中每条序列其中的18-25个碱基，可特异性地扩增看家基因片段。一种用于融合基因检测的试剂，包括上述的引物组合物。在本专利技术一个较佳实施例中，可测融合形式为下表融合形式中的部分或全部：在本专利技术一个较佳实施例中，所述用于融合基因检测的试剂还包括用于检测融合基因扩增产物的探针组合物，所述探针组合物中的探针序列包括SEQIDNO.55～70所示的序列。在本专利技术一个较佳实施例中，所述探针组合物中的探针序列包括序列中的部分或全部：所述序列选取SEQIDNO.55～70所示的序列中每条序列其中的20-32个碱基。在本专利技术一个较佳实施例中，所述探针组合物中探针5’端能连接荧光报告基团，探针3’端能选择性地连接荧光猝灭基团。在本专利技术一个较佳实施例中，所述用于融合基因检测的试剂在来自新鲜或冰冻组织、全血、FFPE的RNA样本的融合基因检测中的用途。在本专利技术一个较佳实施例中，所述用于融合基因检测的试剂在基于qPCR或NGS方法的融合基因检测中的用途。本专利技术的有益效果是：一、本专利技术所述的引物组合物，可一次性地检测RNA样本中ALK、NRG、NTRK1、RET、ROS1等5种常见融合驱动基因的至少50种融合基因形式，满足肺癌肿瘤辅助诊断、用药、预后等的一般需要。二、本专利技术所述的引物组合物，既可在同一管反应中检测所有的融合形式，也可根据需要拆分开来分别检测不同的融合形式，以适应不同报告手段的需要。使用一管反应时，后续可通过NGS的形式来报告融合，相对于一般NGS检测融合的方法具有总体耗时短、成本低的优势；使用分管反应，并结合本专利技术所述的探针组合物，利用qPCR手段来报告融合时，又具有可测融合形式较多，灵敏度高等特点，能测出低至0.04ng样本中的融合基因。三、本专利技术所涉及方法简单，总体成本低，填补了国内多重PCR技术检测融合基因的空白。本专利技术有助于实现试剂从实验室向临床应用和体外诊断试剂的转化，具有良好的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：图1是本专利技术实施例二中H2228细胞株ALK融合和看家基因检测结果图；图2是本专利技术实施例二中HCC78细胞株ROS1融合和看家基因检测结果图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。下述实施例中，使用Qiagen公司的RNeasyMiniKit(货号：74104)提取细胞系样本的RNA；使用Magen公司的HiPureFFPERNAPlusKit(货号：R4144)提取FFPE样本的RNA；使用ThermoFisher公司的QubitdsRNAHSAssayKit(货号：Q32852/Q32855)对提取的RNA进行定量。由于荧光定量PCR仪的荧光通道有限，为区分不同的融合驱动基因和看家基因，故将探针组合物分为两组，见下表。每个样本进行检测时，如无特殊说明，也分两管进行。实施例一：一、样本准备分别提取下表所示各细胞株的总RNA，Qubit定量。细胞株融合形式H2228EML4-ALKKM12TPM3-NTRK1LC-2/adCCDC6-RETHCC78SLC34A2-ROS1A549无(阴性)二、实验流程：(1)按下表所示配制qPCR反应液，每管分别加入4种RNA样本。(2)盖上管盖，颠倒混匀，避免产生气泡，然后快速离心。(3)按下表程序运行qPCR反应。三、检测结果<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物中的引物包括SEQ ID NO.1～52所示的序列中的部分或全部，可特异性地扩增融合基因片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物中的引物包括SEQIDNO.1～52所示的序列中的部分或全部，可特异性地扩增融合基因片段。


2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物包括序列中的部分或全部：所述序列选取SEQIDNO.1～52所示的序列中每条序列其中的18-25个碱基，可特异性地扩增融合基因片段。


3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物中的引物还包括SEQIDNO.53～54所示的序列，可特异性地扩增看家基因片段。


4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，所述引物包括SEQIDNO.53～54所示的序列中每条序列其中的18-25个碱基，可特异性地扩增看家基因片段。


5.一种用于融合基因检测的试剂，其特征在于，包括权利要求1-4任一所述的引物组合物。


6.根据权利要求5所述的用于融合基因检测的试剂，其特征在于，融合形式为以下融合形式中的部分或全部：
第一融合形式：5’端基因：EML4(e13)，3’端基因：ALK(e20)；
第二融合形式：5’端基因：EML4(e6)，3’端基因：ALK(e20)；
第三融合形式：5’端基因：EML4(e20)，3’端基因：ALK(e20)；
第四融合形式：5’端基因：EML4(e2)，3’端基因：ALK(e20)；
第五融合形式：5’端基因：EML4(e14)，3’端基因：ALK(e20)；
第六融合形式：5’端基因：EML4(e15)，3’端基因：ALK(e20)；
第七融合形式：5’端基因：EML4(e18)，3’端基因：ALK(e20)；
第八融合形式：5’端基因：EML4(e6)，3’端基因：ALK(e19)；
第九融合形式：5’端基因：KIF5B(e15)，3’端基因：ALK(e20)；
第十融合形式：5’端基因：KIF5B(e17)，3’端基因：ALK(e20)；
第十一融合形式：5’端基因：KIF5B(e24)，3’端基因：ALK(e20)；
第十二融合形式：5’端基因：TFG(e4)，3’端基因：ALK(e20)；
第十三融合形式：5’端基因：TFG(e5)，3’端基因：ALK(e20)；
第十四融合形式：5’端基因：TPR(e15)，3’端基因：ALK(e20)；
第十五融合形式：5’端基因：HIP1(e28)，3’端基因：ALK(e20)；
第十六融合形式：5’端基因：HIP1(e30)，3’端基因：ALK(e20)；
第十七融合形式：5’端基因：KLC1(e9)，3’端基因：ALK(e20)；
第十八融合形式：5’端基因：STRN(e3)，3’端基因：ALK(e20)；
第十九融合形式：5’端基因：CD74(e18)，3’端基因：NTRK1(e10)；
第二十融合形式：5’端基因：TPM3(e8)，3’端基因：NTRK1(e10)；
第二十一融合形式：5’端基因：TFG(e5)，3’端基因：NTRK1(e10)；
第二十二融合形式：5’端基因：MPRIP(e14)，3’端基因：NTRK1(e12)；
第二十三融合形式：5’端基因：MPRIP(e18)，3’端基因：NTRK1(e12)；
第二十四融合形式：5’端基因：MPRIP(e21)，3’端基因：NTRK1(e12)；
第二十五融合形式：5’端基因：CD74(e8)，3’端基因：NRG1(e6)；
第二十...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋钢，王朝晖，
申请(专利权)人：上海真固生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31