一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物及其试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物，包括：131对第一引物；每对所述第一引物包括正向引物与反向引物，且所述正向引物与反向引物均包括扩增引物对及与所述扩增引物对5

【技术实现步骤摘要】
一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物及其试剂


[0001]本专利技术涉及基因工程技术的
，特别涉及一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物及其试剂。

技术介绍

[0002]下一代测序技术(Next
‑
Generation Sequencing，NGS)，又称二代测序技术，是近年来兴起的可以一次对数十万乃至数亿条DNA分子进行测序的高通量检测技术，目前已广泛地应用于产前检测，肿瘤突变分析和用药指导，病原体微生物筛查等领域。Illumina平台现在是国内最常用的NGS测序仪，市场占有率较高。Ion Torrent平台和国产的MGI平台也各自具有独特的优点，国内的应用比率也在稳步增长中。
[0003]进行NGS测序前，通常需要先对样本DNA的特定区域进行富集和扩增，这个过程称为文库构建。目前主流的建库技术包括两种：探针杂交捕获技术和多重PCR技术。杂交捕获技术的优点是探针序列的设计难度较低，一套探针库适合多种类型的样本，因此是国内主流的建库技术。但是杂交捕获的建库流程比较复杂，经常耗时需48小时甚至更长，而且整体成本高；同时由于建库之前通常需要对组织样本进行超声、酶解等预处理，因此对样本的起始量和质量都有较多的要求。
[0004]相比之下，多重PCR技术无需对样本进行预处理，较少量的样本或者一定程度降解的样本也可使用，适合临床上绝大部分情况；同时建库流程简单，数小时即可完成，总体成本也较低。但多重PCR技术对扩增引物池的设计提出了较高的要求，稍有差错就容易产生大量引物二聚体导致目的片段急剧减少，或者不得不分管操作，削弱了原本具有的优势。目前国内基于多重 PCR的建库技术以Thermo Fisher(赛默飞)的AmpliSeq系列试剂为主，自研的产品尚处于空白状态。
[0005]地中海贫血症相关基因的检测过程中，样本类型是外周血gDNA，主要检测胚系相关变异。样本的处理并不复杂，关键在于如何实现高效的单管检测。前文已经说过多重PCR技术对于引物池的设计要求比较高，稍有差错就容易产生大量引物二聚体导致目的片段急剧减少，尤其是对于基因拷贝数变异 (CNV)的检测，需要设计intron区域的扩增子，很容易引起非特异性的扩增，同时对于如何准确检测CNV也是一个难题。
[0006]液体活检(Liquid Biopsy)是收集外周血中从肿瘤脱落的循环肿瘤细胞 (CTC)、外泌体(Exosome)，或是提取肿瘤组织凋亡释放到血液中的循环肿瘤DNA(ctDNA)进行基因检测的技术。与传统的肿瘤组织手术取样或穿刺取样相比，液体活检具有创伤小，时效性高，能克服肿瘤异质性(可反映肿瘤整体而不仅是取样局部的信息)等特点，在癌症早筛、疗效评估、复发监测等领域可以发挥重要作用。
[0007]制备完成的文库在NGS测序之前还需要在末端连接上可被测序仪识别的 DNA接头，其中含有测序引物结合位点，用于区分不同样本的Barcode，某些情况下还有区分样本中不同DNA分子的UID(unique identifier)等。其中UID片段是由6
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18个随机碱基序列(A、G、C或T)组成的分子标记，在扩增ctDNA样本时，可以为每一条ctDNA分子带上不同的独特序
列标记，减少由于扩增错误带来的测序背景噪音。由于各测序仪厂商加接头的原理、试剂、以及Barcode、UID片段的序列、长度都有所差别，故而设计在一种测序平台上使用的文库构建试剂(杂交捕获探针库/多重PCR引物池)通常不适合在其他平台上使用，造成了一定的不便。

技术实现思路

[0008]针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术的目的是提供一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物，结合指南及权威数据库，除了可以检测常见的SNV 和short indel之外，还可以检测复杂的CNV突变，扩增子的比对率、中靶率和均一度都较好。为了实现根据本专利技术的上述目的和其他优点，提供了一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物，包括：
[0009]131对第一引物；
[0010]每对所述第一引物包括正向引物与反向引物，且所述正向引物与反向引物均包括扩增引物对及与所述扩增引物对5
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端连接的其他序列；
[0011]每对所述正向引物与反向引物的特异性序列选自SEQ ID NO.1～262所示的序列。
[0012]优选的，每对所述正向引物与反向引物中的特异性序列为所述序列其中的18
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25个碱基序列。
[0013]优选的，所述扩增引物对的正向引物包括SEQ ID NO.263所示的序列，优选地，为所述序列其中的16
‑
25个碱基序列。
[0014]优选的，所述扩增引物对的反向引物包括SEQ ID NO.264所示的序列，优选地，为所述序列其中的16
‑
25个碱基序列。
[0015]优选的，所述引物组合物应用于检测地中海贫血症突变基因中。
[0016]一种用于地中海贫血症基因检测的试剂包括权利要求1
‑
4任一项的所述引物组合物。
[0017]优选的，还包括三对接头，三对所述接头分别对应Illumina、IonTorrent、MGI三种测序平台，所述接头内部含有与权利要求3或4任一项所述的序列配对的DNA片段。
[0018]优选的，所述试剂用于外周血gDNA的分子检测。
[0019]优选的，所述试剂应用于基于NGS方法的地中海贫血症相关基因检测中。
[0020]本专利技术与现有技术相比，其有益效果是：
[0021]1.本专利技术所述的引物组合物的设计，是结合相关指南及权威数据库，精选了HBA1/2和HBB这3个地中海贫血症相关的重要胚系突变基因，除了可以检测常见的SNV和short indel之外，还可以检测复杂的CNV突变，通过对外周血gDNA检测，一方面可以对疑似地贫患者进行α和/或β地贫的遗传诊断，同时也可以对地贫高风险夫妇进行遗传评估和对胎儿进行产前遗传诊断。扩增子的比对率、中靶率和均一度都较好。
[0022]2.本专利技术在引物池设计时，有较多的扩增子是用于拷贝数扩增(CNV) 的检测和质控，同时有7条扩增子为GAP扩增子。
[0023]3.本专利技术所述的试剂适用于来自地中海贫血症相关基因受检人员的外周血gDNA中相关基因的突变检测，主要用于检测受检人群的地贫相关基因的胚系突变。
[0024]4.本专利技术所述的试剂可根据实际需求，通过更换接头和加接头反应程序无缝适应多种NGS测序平台，扩大了市场受众。
[0025]5.本专利技术所涉及方法简单，操作便捷，可在数小时内完成NGS文库构建，总体成本低，填补了国内地中海贫血症领域多重PCR技术构建NGS文库的空白。本专利技术有助于实现试剂从实验室向临床应用和体外诊断试剂的转化，具有良好的应用前景。
附图说明
[0026]图1为根据本专利技术的地中海贫血症突变基因检测引物组合物的结构示意图；
[0027]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物，其特征在于，包括：131对第一引物；每对所述第一引物包括正向引物与反向引物，且所述正向引物与反向引物均包括扩增引物对及与所述扩增引物对5
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端连接的其他序列；每对所述正向引物与反向引物的特异性序列选自SEQ ID NO.1～262所示的序列。2.如权利要求1所述的一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物，其特征在于，每对所述正向引物与反向引物中的特异性序列为所述序列其中的18
‑
25个碱基序列。3.如权利要求1所述的一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物，其特征在于，所述扩增引物对的正向引物包括SEQ ID NO.263所示的序列，优选地，为所述序列其中的16
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25个碱基序列。4.如权利要求1所述的一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物，其特征在于，所述扩增引物对的反向引物包括SEQ ID NO.264所示的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋钢，王朝晖，王强，
申请(专利权)人：上海真固生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：