雄激素受体剪接变异体-7核酸定量检测方法、内标及试剂盒技术

本发明专利技术公开了雄激素受体剪接变异体‑7核酸定量检测方法、内标及试剂盒。所述试剂盒包括AR‑V7定量检测相关的引物探针组合、内标以及AR‑V7 RT‑PCR法检测相关试剂。且所述试剂盒可在单管内完成AR‑V7的定量检测，定量结果准确，极大的简化了常规的定量操作流程，提高了效率，也降低了检测失误的风险。

【技术实现步骤摘要】
雄激素受体剪接变异体-7核酸定量检测方法、内标及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学检测
，特别是涉及及一种人雄激素受体剪接变异体-7核酸定量检测方法、内标及试剂盒。
技术介绍
前列腺癌是一种常见的恶性肿瘤，并且是造成男性肿瘤死亡的第二大病因。近年来，我国前列腺癌的发病率呈逐年快速上升趋势，2004年为5.8/10万人，到2009年己经上升为8/10万人。由于我国对前列腺癌易感人群的筛查工作相对落后，导致晚期前列腺癌约占初次诊断的前列腺癌的70％，我国初诊为晚期前列腺癌的比例远高于欧美国家(20-30％)。雄激素剥夺治疗(Androgendeprivationtherapy，ADT)是这类前列腺癌患者的最主要治疗方法。尽管在ADT治疗初期前列腺癌被不同程度的控制，但经过一段时间的治疗后，大部分患者的疾病逐渐且不可逆地进展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostatecancer，CRPC)。目前已有的药物阿比特龙与蒽杂鲁胺对于CRPC患者的治疗有较好的效果，但仍然有20％-40％的患者PSA维持在较高的水平，却没有明显的疗效，且多数经阿比特龙与蒽杂鲁胺治疗的患者后期几乎都会发生获得性的耐药。关于阿比特龙与蒽杂鲁胺耐药的机制，文献资料显示，雄激素受体信号通路的异常属于耐药发生的可能机理之一，其中AR-V7是雄激素受体(AR)异常剪接所产生的构体，AR-V7由于缺少配体结合区，可以不依赖雄激素的结合而对下游的信号通路进行持续的活化，引起细胞的异常增殖。进一步的研究也表明，AR-V7阳性与经阿比特龙与蒽杂鲁胺治疗的CRPC患者的PSA响应率以及存活率呈明显的负相关。因此AR-V7的检测在表征CRPC患者治疗效果方面具有重要意义。关于AR-V7的检测，目前市场上已有的仅用于科研服务的产品是凯杰公司生产的AdnaTestProstateCancerPanel，检测的大概流程是：首先采用磁珠法捕获病人的循环肿瘤细胞(CTC)，之后进行mRNA的分离提取以及逆转录，最后通过qRT-PCR法完成AR-V7的定性检测，并不进行定量。AR-V7常规的定量方法主要包括：ddPCR检测直接进行定量以及qPCR检测利用标准曲线进行定量。ddPCR检测比较明显的劣势在于操作流程繁琐，时间长，成本高。qPCR标准曲线定量，每次试验均需对标准曲线的配置与检测，操作繁琐。本专利技术提供的AR-V7定量检测试剂盒则可以在单管内实现AR-V7的定量检测，操作更加简单、快捷，且成本更低。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术通过单管内同步检测AR-V7以及AR-V7的内标(AR-V7QS)，利用AR-V7Ct值与AR-V7QSCt值的差值即ΔCt来对AR-V7进行定量。通常条件下，引物不同，则会导致引物的扩增效率不同，本专利技术提供的AR-V7与AR-V7QS检测共用上下游引物，探针的设计碱基组成相同而排列顺序不同，进一步最大限度的保证了二者具有相同的扩增效率，从而可以直接利用ΔCt来直接对AR-V7进行定量。为实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案包括：本专利技术提供一种荧光PCR定量检测AR-V7的方法，包括：S1、提供一包括AR-V7和已知浓度或模板量的AR-V7QS内标的荧光PCR反应体系；所述荧光PCR反应体系还包括用于检测AR-V7的上、下游引物及探针，以及用于检测AR-V7QS的上、下游引物及探针，其中用于检测AR-V7的上、下游引物序列分别与用于检测AR-V7QS的上、下游引物序列相同；所述AR-V7QS包括与所述AR-V7相同的上、下游引物识别序列，以及位于上、下游引物识别序列之间的探针识别序列Ⅰ；所述AR-V7包括位于上、下游引物识别序列之间的探针识别序列Ⅱ；所述探针识别序列Ⅰ与所述探针识别序列Ⅱ的碱基组成相同而碱基排列顺序不同；S2、进行扩增反应，并检测AR-V7和AR-V7QS二者的Ct值，则所述样本中AR-V7的浓度或模板量(即AR-V7copies)采用如下的公式计算，AR-V7浓度＝(2^ΔCт)×AR-V7QS浓度，AR-V7模板量＝(2^ΔCт)×AR-V7QS模板量，其中ΔCт为AR-V7QS的Ct值与AR-V7的Ct值的差值。其中，所述探针识别序列或其互补序列用于与探针的结合；所述上、下游引物识别序列或其互补序列分别与上、下游引物结合，并可引发后续的链延伸反应。其中，所述碱基组成相同是指所述探针识别序列Ⅰ与所述探针识别序列Ⅱ中A、T、G、C的数量均相同，所述碱基排列顺序不同是指所述探针识别序列Ⅰ与所述探针识别序列Ⅱ中碱基的排列顺序不完全相同，可以有效避免检测探针之间的相互干扰。所述检测探针之间的相互干扰是指探针与靶序列的结合出现错配，即AR-V7QS序列(比如AR-V7QS的探针识别序列Ⅰ或其互补序列)与AR-V7探针发生结合，或者AR-V7序列(比如AR-V7的探针识别序列Ⅱ或其互补序列)与AR-V7QS探针发生结合，这种错配可能会产生干扰的荧光信号，影响定量检测的准确性。本专利技术中通过对探针识别序列及探针序列的设计，可以有效避免检测探针之间的相互干扰，保证检测结果的准确性。进一步的，所述用于检测AR-V7QS的探针序列与所述探针识别序列Ⅰ相同或互补，所述用于检测AR-V7的探针序列与所述探针识别序列Ⅱ相同或互补。进一步的，所述用于检测AR-V7QS的上、下游引物序列分别与AR-V7QS的上、下游引物识别序列相同或互补，所述用于检测AR-V7的上、下游引物序列分别与AR-V7的上、下游引物识别序列相同或互补。进一步的，所述探针识别序列Ⅰ与所述探针识别序列Ⅱ中至少4个碱基的排列顺序不同，或者至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个碱基的排列顺序不同。进一步的，所述AR-V7QS在除所述探针识别序列Ⅰ之外的区域与所述AR-V7在除所述探针识别序列Ⅱ之外的区域序列相同。进一步的，所述AR-V7QS的序列为：TTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTGATAGCAAGAGGGTACTCTGGGAGAAAAATTCCGGGTTGGCAATTG，其中下划线部分为所述探针识别序列Ⅰ。进一步的，所述用于检测AR-V7QS的上、下游引物及探针分别为：AR-V7QS正向引物(即上游引物)：TTGTCCATCTTGTCGTCTTCGAR-V7QS反向引物(即下游引物)：CAATTGCCAACCCGGAATTTAR-V7QS探针：TGATAGCAAGAGGGTA。进一步的，所述用于检测AR-V7的上、下游引物及探针分别为：AR-V7正向引物(即上游引物)：TTGTCCATCTTGTCGTCTTCGAR-V7反向引物(即下游引物)：CAATTGCCAACCCGGAATTTAR-V7探针：TATGAAGCAGGGATGA。进一步的，在50uL的扩增反应体系中，所述AR-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光PCR定量检测AR-V7的方法，其特征在于，包括：/nS1、提供一包括AR-V7和已知浓度或模板量的AR-V7 QS内标的荧光PCR反应体系；/n所述荧光PCR反应体系还包括用于检测AR-V7的上、下游引物及探针，以及用于检测AR-V7 QS的上、下游引物及探针，其中用于检测AR-V7的上、下游引物序列分别与用于检测AR-V7 QS的上、下游引物序列相同；/n所述AR-V7 QS包括与所述AR-V7相同的上、下游引物识别序列，以及位于上、下游引物识别序列之间的探针识别序列Ⅰ；所述AR-V7包括位于上、下游引物识别序列之间的探针识别序列Ⅱ；/n所述探针识别序列Ⅰ与所述探针识别序列Ⅱ的碱基组成相同而碱基排列顺序不同；/nS2、进行扩增反应，并检测AR-V7和AR-V7 QS二者的Ct值，则所述样本中AR-V7的浓度或模板量采用如下的公式计算，/nAR-V7浓度＝(2^ΔCт)×AR-V7 QS浓度，/nAR-V7模板量＝(2^ΔCт)×AR-V7 QS模板量，/n其中ΔCт为AR-V7 QS的Ct值与AR-V7的Ct值的差值。/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光PCR定量检测AR-V7的方法，其特征在于，包括：
S1、提供一包括AR-V7和已知浓度或模板量的AR-V7QS内标的荧光PCR反应体系；
所述荧光PCR反应体系还包括用于检测AR-V7的上、下游引物及探针，以及用于检测AR-V7QS的上、下游引物及探针，其中用于检测AR-V7的上、下游引物序列分别与用于检测AR-V7QS的上、下游引物序列相同；
所述AR-V7QS包括与所述AR-V7相同的上、下游引物识别序列，以及位于上、下游引物识别序列之间的探针识别序列Ⅰ；所述AR-V7包括位于上、下游引物识别序列之间的探针识别序列Ⅱ；
所述探针识别序列Ⅰ与所述探针识别序列Ⅱ的碱基组成相同而碱基排列顺序不同；
S2、进行扩增反应，并检测AR-V7和AR-V7QS二者的Ct值，则所述样本中AR-V7的浓度或模板量采用如下的公式计算，
AR-V7浓度＝(2^ΔCт)×AR-V7QS浓度，
AR-V7模板量＝(2^ΔCт)×AR-V7QS模板量，
其中ΔCт为AR-V7QS的Ct值与AR-V7的Ct值的差值。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于检测AR-V7QS的探针序列与所述探针识别序列Ⅰ相同或互补，所述用于检测AR-V7的探针序列与所述探针识别序列Ⅱ相同或互补。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于检测AR-V7QS的上、下游引物序列分别与AR-V7QS的上、下游引物识别序列相同或互补，所述用于检测AR-V7的上、下游引物序列分别与AR-V7的上、下游引物识别序列相同或互补。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针识别序列Ⅰ与所述探针识别序列Ⅱ中至少4个碱基的排列顺序不同。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述AR-V7QS在除所述探针识别序列Ⅰ之外的区域与所述AR-V7在除所述探针识别序列Ⅱ之外的区域序列相同。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述AR-V7QS的序列为：
TTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTGATAGCAAGAGGGTA
CTCTGGGAGAAAAATTCCGGGTTGGCAATTG，其中下划线部分为所述探针识别序列Ⅰ。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述用于检测AR-V7QS的上、下游引物及探针分别为：
AR-V7QS上游引物：TTGTCCATCTTGTCGTCTTCG
AR-V7QS下游引物：CAATTGCCAACCCGGAATTT
AR-V7QS探针：TGATAGCAAGAGGGTA。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述用于检测AR-V7的上、下游...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓楠，乔春晓，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31