【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种细胞穿透降解抗体(也称为“降解体(degrobody)”)、包括该抗体的组合物及其用途，所述细胞穿透降解抗体穿透活细胞的胞浆，从而特异性识别、降解和去除胞浆中的靶蛋白。本专利技术涉及一种细胞穿透降解抗体、包括该抗体的组合物及其用途，所述细胞穿透降解抗体模拟泛素-蛋白酶体系统(ups)的机制和功能，该泛素-蛋白酶体系统是一种细胞内蛋白质降解系统，从而特异性降解由抗体识别的靶蛋白。本专利技术涉及一种细胞穿透降解抗体(cell-penetrating degrading antibody)、包括该抗体的组合物及其用途，所述细胞穿透降解抗体通过将穿透活细胞的胞浆(cytosol)并特异性识别靶蛋白的细胞/组织特异性胞浆穿透干扰抗体(cytosol-penetrating interfering antibody)(imab)与能够与e2(泛素缀合酶)结合的e3的u-盒(u-box)(泛素连接酶)进行融合而形成，所述e2是一系列的ups酶之一。更具体地，本专利技术涉及一种细胞穿透降解抗体，其通过将穿透活细胞的胞浆并特异性识别靶蛋白的细胞/组织特异性胞浆穿透干扰抗体(imab)与能够与e2结合的e3的u-盒进行融合而形成，所述e2是一系列的ups酶之一，以通过e2诱导与胞浆穿透干扰抗体结合的靶蛋白的多泛素化(poly-ubiquitination)(多-ub(poly-ub))，并由此最终引起ups对靶蛋白的降解。本专利技术涉及一种细胞穿透降解抗体、包括该抗体的组合物及其用途，所述细胞穿透降解抗体通过将穿透活细胞的胞浆并特异性识别靶蛋白的细胞/组
技术介绍
1、细胞内蛋白质降解通过基于溶酶体和蛋白酶体的两条途径发生。大约80％的细胞蛋白质被泛素(ub)标记，然后在胞浆和细胞核中被蛋白酶体降解。这个过程被称为“泛素-蛋白酶体系统(ups)”。由泛素介导的降解控制系统不仅通过去除受损或不必要的蛋白质来维持细胞稳态，还参与应随着时间的推移而被精确调控的细胞周期过程和转录控制过程。与ups相关的问题可能会导致各种疾病，包括癌症。另一方面，有人提出，通过激活ups途径来去除致病蛋白可为一种根本的治疗方法。
2、泛素是一种由76个氨基酸组成的蛋白质并且几乎存在于所有真核细胞中。泛素激活酶(e1)、泛素缀合酶(ubiquitin conjugating enzyme)(e2)和泛素连接酶(ubiquitinligase enzyme)(e3)等一系列酶系统皆参与标记过程，以便使泛素选择性地降解蛋白质，这被称为“泛素化”。对其中将底物蛋白(底物)用泛素链进行链接/多重标记的多泛素化(多-ub)进行诱导，经多泛素化的靶蛋白被转移到26s蛋白酶体(一种atp依赖性蛋白酶复合物)，被解折叠，并且被降解。换句话说，ups是由三种酶即e1、e2和e3组成的系统。e1激活ub，e2接受经激活的ub以形成e2-ub(e2-泛素缀合物)，e3结合e2-ub和底物以使蛋白质多泛素化，并且经多泛素化的底物在蛋白酶体中被降解。ub与蛋白质底物的结合是通过底物分子的lys(赖氨酸)残基之间的异肽键的形成而发生的，并且另一个ub可以与ub的c-末端的gly(甘氨酸)残基结合。通过重复这一过程，多-ub被与底物蛋白相连的多个ub分子标记，该蛋白被26s蛋白酶体识别并被选择性降解。
3、人ups预计有2种类型的e1、40种类型的e2和600种类型的e3。e1激活ub，e2接收经激活的ub以形成e2-ub。e3与底物蛋白和e2-ub结合，使得底物蛋白位于e2-ub附近，以诱导底物蛋白的多-ub转化。特别地，根据特征结构域结构的存在和递送ub的机制方面的差异，将e3分类为ring(真正感兴趣的新基因)e3、hect(与e6ap羧基末端同源)e3以及rbr(ring与ring间)e3。重要的是，e3与e2-ub和底物蛋白两者都结合，这提供了用以识别要用ub标记的底物蛋白的特异性。换句话说，待降解蛋白质的多泛素化由e3酶决定。在这种情况下，所有底物蛋白都有ub连接位点和特异性e3的识别位点。考虑到细胞中大约有100,000种蛋白质，每个e3不仅具有底物特异性，还具有冗余性和多样性。
4、用于降解底物蛋白的ring e3是基于以下机制：e2-ub和底物蛋白(底物)在空间上彼此靠近，e2-ub的ub不穿过e3直接转移到底物蛋白上。ring e3包括1)单体ring(例如，c-cbl)、同二聚体ring(例如，ciap)和异型二聚体ring(例如，mdm2-mdmx)，作为cullin非依赖性形式(作为单一蛋白质仅具有e3活性)，如图1a所示，以及2)cullin-ring e3泛素连接酶(crl)，作为cul本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种与β-连环蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，包括：
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包括选自由SEQ ID NO:17至19组成的组的重链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包括SEQ ID NO:20或21的轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段降低了存在于由β-连环蛋白诱导的Wnt信号传导通路的Wnt靶基因的表达。
5.一种与β-连环蛋白结合的胞浆穿透干扰抗体，包括根据权利要求1所述的与β-连环蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，以及靶向肿瘤细胞或组织特异性抗原的物质，
6.根据权利要求5所述的胞浆穿透干扰抗体，其中，所述肿瘤细胞或组织特异性抗原包括选自由上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)和整联蛋白αvβ3/αvβ5组成的组的至少一种。
7.一种细胞穿透降解抗体(降解体)，其通过进一步将根据权利要求5所述的胞浆穿透干扰抗体与U-盒或E3招募子融合而设计。
8.根据权利要求7所述的细
9.根据权利要求8所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述U-盒包括SEQID NO:10或11的序列。
10.根据权利要求7所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述E3招募子包括选自由βTrCP142-255、VHL152-213、SPOP167-374、DDB261-114和SOCS2153-198组成的组的至少一种。
11.根据权利要求7所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述E3招募子是具有改善的表达水平的SOCS2153-198变体，并且包括选自由SEQ ID NO:12至16以及23至34组成的组的至少一种。
12.根据权利要求7所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述U-盒或E3招募子与抗β-连环蛋白抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N-末端或C-末端融合。
13.根据权利要求12所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述U-盒或E3招募子通过接头与所述抗β-连环蛋白抗体或其抗原结合片段连接。
14.根据权利要求13所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述接头包括选自由GGGGS、(GGGGS)2、ASTKGP和ASTKGPSVFPLAP组成的组的至少一种。
15.一种编码根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸。
16.一种编码根据权利要求5或6所述的胞浆穿透干扰抗体的核酸。
17.一种编码根据权利要求5至14中任一项所述的细胞穿透降解抗体的核酸。
18.一种包括根据权利要求15至17中任一项所述的核酸的表达载体。
19.一种用根据权利要求18所述的表达载体转化的重组细胞。
20.一种产生抗β-连环蛋白抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
21.一种产生根据权利要求7至14中任一项所述的细胞穿透降解抗体的方法，包括：
22.一种包括生物活性分子的缀合物，所述生物活性分子与根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求5和6中任一项所述的胞浆穿透干扰抗体和根据权利要求7至14中任一项所述的细胞穿透降解抗体连接。
23.一种双特异性或多特异性抗体，其包括根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求5或6的胞浆穿透干扰抗体和根据权利要求7至14中任一项所述的细胞穿透降解抗体。
24.一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包括根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求5或6的胞浆穿透干扰抗体和根据权利要求7至14中任一项所述的细胞穿透降解抗体。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种与β-连环蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，包括：
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包括选自由seq id no:17至19组成的组的重链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包括seq id no:20或21的轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段降低了存在于由β-连环蛋白诱导的wnt信号传导通路的wnt靶基因的表达。
5.一种与β-连环蛋白结合的胞浆穿透干扰抗体，包括根据权利要求1所述的与β-连环蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，以及靶向肿瘤细胞或组织特异性抗原的物质，
6.根据权利要求5所述的胞浆穿透干扰抗体，其中，所述肿瘤细胞或组织特异性抗原包括选自由上皮细胞粘附分子(epcam)、表皮生长因子受体(egfr)和整联蛋白αvβ3/αvβ5组成的组的至少一种。
7.一种细胞穿透降解抗体(降解体)，其通过进一步将根据权利要求5所述的胞浆穿透干扰抗体与u-盒或e3招募子融合而设计。
8.根据权利要求7所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述u-盒为包括e4b(e4多泛素链延伸因子b)的单体u-盒，或包括chip(hsp70相互作用蛋白的羧基末端)或prp19(前体mrna剪接因子19)的同二聚体u-盒。
9.根据权利要求8所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述u-盒包括seqid no:10或11的序列。
10.根据权利要求7所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述e3招募子包括选自由βtrcp142-255、vhl152-213、spop167-374、ddb261-114和socs2153-198组成的组的至少一种。
11.根据权利要求7所述的细胞穿透降解抗体，其中，所述e3招募子是具有改善的表达水平的socs2153-198变体，并且包括选自由seq id no:12至16以及2...
【专利技术属性】
技术研发人员：金容星，D·李，徐智绣，权惠辰，金大成，
申请(专利权)人：亚洲大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：
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