本发明专利技术提供了一种一步均相D‑二聚体检测试剂盒及其在检测D‑二聚体含量中的应用，所述试剂盒包括：(1)抗D‑二聚体抗体偶联的发光微球试液；(2)抗D‑二聚体抗体偶联的感光微球试液；以及能够接收和发射光的反应孔。与现有技术相比，本发明专利技术试剂盒具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点，并且特异性强。将其应用于高凝状态和血栓性疾病的监测，可以提高高凝状态和血栓性疾病的准确率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检测试剂盒领域，特别涉及一种一步均相D-二聚体检测试剂盒及其应用。
技术介绍
纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统。在纤溶过程中，凝血酶在水解纤维蛋白原后，即相继释放出纤维蛋白肽(A和B)，剩余的可溶性纤维蛋白单体，在因子Ⅻa作用下，形成稳定的交联纤维蛋白，交联纤维蛋白在纤溶酶的降解过程中，释放的碎片进一步降解为最小片段D-二聚体。在病理状态下，凝血与纤溶的动态平衡遭到破坏，凝血倾向增强，从而纤维蛋白降解产物增加，导致D-二聚体含量增加。D-二聚体水平的增高，表明体内有纤维蛋白血栓形成和纤溶发生，所以临床上可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子指标。D-二聚体来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块。凝血系统激活使凝血酶作用于纤维蛋白原，将其转变成纤维蛋白单体(α、β、γ)2即D-E-D结构，并有规则连接为可溶性纤维蛋白单体聚合体(SFMC)。后者进一步在Ca2+与ⅩⅢa作用下，单体间发生α链与γ链交联(D-D交联)形成稳定的不溶性纤维蛋白聚合体。交联纤维蛋白的生成又激活纤溶酶溶解系统。纤维蛋白溶解系统由纤溶酶原、纤溶酶原激活剂、纤溶酶溶解酶、纤溶酶溶解酶抑制物4个主要部分组成。当纤维蛋白凝结块形成时，在组织型纤溶酶溶解酶原激活物存在的条件下，纤溶酶溶解酶原激活转化为纤溶酶溶解酶，纤维蛋白溶解过程开始，纤溶酶溶解酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段(X'、Y'、D、E等碎片)。D-二聚体是通过γ链相连的2个D碎片连接起来的片段(DD、DXD、DD/E、YXD等复合物)，是交联纤维蛋白的特异性降解产物。D-二聚体在临床检验中应用的十分广泛。有研究表明，心血管疾病由于血管壁的损伤、血小板的激活、凝血机制的亢进及血液状态的变化，使循环血液中的有形成分在心脏或血管内形成异常凝块，堵塞部分或全部血管腔导致急性心肌梗死或脑梗死，引起D-二聚体含量升高。脑梗死D-二聚体检测结果及阳性率最高。有资料显示其含量与梗死面灶的体积及病情轻重呈明显正相关。动态测定血浆D-二聚体含量可作为急性脑梗死病程判断及疗效观察的有用指标。对妊娠高血压综合征患者血浆D-二聚体的测定结果表明，妊娠高血压综合征患者血浆D-二聚体高于正常晚孕妇女，而且随病情的发展而明显升高，故认为D-二聚体升高是妊娠高血压综合征导致弥散性血管内凝血(DIC)
时最早出现的阳性指标。大量临床资料证明，恶性肿瘤存在纤溶活性亢进，这与恶性肿瘤细胞具有高水平的纤维蛋白溶解酶激酶有关，并可分泌大量纤维蛋白原激活物，其主要类型是尿激酶型，能导致局部纤维蛋白溶解，使D-二聚体水平升高。D-二聚体含量与恶性肿瘤病情进展有相关性。D-二聚体作为交联纤维蛋白的特异降解产物，其水平的增高反映着继发性纤溶的增强，在临床上已被视为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。动态观察患者体内的D-二聚体水平变化，对高凝状态和血栓性疾病的诊断及预后判断有一定实用价值。目前用于检测D-二聚体的方法主要有放射性免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)，胶体金免疫层析法(GICA)和化学发光免疫分析法(CLIA)。RIA有很高的检测灵敏度，但由于标记物具有放射性危害，标记物稳定性差，废弃物难以处理等缺点，已逐渐退出临床检验领域；ELISA法采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或碱性磷酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但ELISA法的检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目；GICA具有操作简单，检测速度快等优点，但也存在灵敏度低，试剂不稳定，重复性较差，难以进行定量的缺点。CLIA具有操作简单，检测速度快、高通量检测等优点，但也存在非均相反应、检测时间长、实际稳定性差、批内批间变异大的缺点。
技术实现思路
专利技术目的：为解决上述问题，本专利技术利用D-二聚体的抗体，以氧通道化学发光技术为平台，研发出一种针对高凝状态和血栓性疾病诊断的D-二聚体快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点；将其应用于高凝状态和血栓性疾病的监测，可以提高高凝状态和血栓性疾病的准确率。技术方案：本专利技术提供了一种一步均相D-二聚体检测试剂盒，包括：(1)抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液；(2)抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液；(3)分析缓冲液；以及能够接收和发射光的反应孔。作为优选，所述抗D-二聚体抗体为针对D-二聚体不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体，其可通过常规免疫学方法获得。所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或Thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，发光微球大小为100-300nm，该微球可由市场购得，如铂金埃尔默公司。所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，感光微球带有光激发产生单线态氧的染料，如酞箐染料、叶绿素等，感光微球大小为100-300nm，该微球可由市场购得，如铂金埃尔默公司。所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球，其中发光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为(1-100):1；所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液的浓度为10-200μg/ml。所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球，其中感光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为(1-100):1；所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液的浓度为10-200μg/ml。所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管等。所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEPES 0.1-2g、BSA0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液或抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液主要由以下步骤制成：(1)将抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤，抗体稀释到1mg/ml备用；取发光微球或者感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；(2)将抗体溶液加入到发光微球或感光微球中，重悬；(3)加入10％Tween20；(4)加入400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足；(5)37℃震荡反应24-48小时；(6)封闭：用800mMNaOH配制65mg/ml CMO溶液，加到反应体系中；(7)37℃震荡反应；(8)离心，去除上清；(9)加入Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；(10)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。本专利技术还提供了所述一步均相D-二聚体检测试剂盒在检测D-二聚体含量中的应用。其中，检测方法包括以下步骤：(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液和抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液，混合反应5-60分钟；(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种一步均相D‑二聚体检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)抗D‑二聚体抗体偶联的发光微球试液；(2)抗D‑二聚体抗体偶联的感光微球试液；(3)分析缓冲液；以及能够接收和发射光的反应孔。
【技术特征摘要】
1.一种一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，包括：(1)抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液；(2)抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液；(3)分析缓冲液；以及能够接收和发射光的反应孔。2.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体抗体为针对D-二聚体不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。3.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基或氨基，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子，发光微球大小为100-300nm；所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基或氨基，感光微球带有光激发产生单线态氧的染料，感光微球大小为100-300nm。4.根据权利要求3所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述发光化合物为二氧杂环己烯或二甲基噻吩的衍生物，镧系元素化合物为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen；所述染料为酞箐染料或叶绿素。5.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球，其中发光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为(1-100):1；所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液的浓度为10-200μg/ml。6.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球，其中感光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为(1-100):1；所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液的浓度为10-200μg/ml。7.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管；所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEP...
【专利技术属性】
技术研发人员：李明明，张春东，黄宝福，淳林，
申请(专利权)人：南京普朗医疗设备有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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