本发明专利技术公开了一种一步均相IL‑6检测试剂盒，主要组成包括：抗IL‑6抗体偶联的发光微球、抗IL‑6抗体偶联的感光微球、分析缓冲液、反应孔；本发明专利技术还公开了所述一步均相IL‑6检测试剂盒的制备方法，该方法包括：抗IL‑6抗体偶联发光微球的制备；抗IL‑6抗体偶联感光微球的制备，以及分析缓冲液的制备；最后本发明专利技术公开了一步均相IL‑6检测试剂盒的使用方法；本发明专利技术的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、检测范围宽、重复性好，操作简单，免清洗等特点，将其应用于感染的监测，可以提高脓毒血症诊断的准确率，便于临床检测使用，具有极大的市场价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及IL-6含量检测领域，具体涉及一种一步均相IL-6检测试剂盒及其制备和使用方法。
技术介绍
急性时相蛋白(acute phase protein，APP)是与感染性炎症紧密相关的一类特异性蛋白。近年来，大量研究表明，多种正负性急性期蛋白与感染性炎症均具有显著的相关性，且比检测白细胞、血沉、酶活性与含量变化等方法更加准确和可靠，可作为感染性炎症的炎症标志物。白介素-6(IL-6)是于1982年首次由Content等从鼠成纤维细胞中检测到的。是一种由多种组织细胞产生(主要是巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞)，具有多种复杂生理功能的、由184个氨基酸组成、分子量为26kD的多肽类细胞因子。当机体发生炎症反应和感染时，病毒、内毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、血小板源生长因子等多种细胞因子可以诱导机体产生IL-6。IL-6生物学作用非常广泛，它可以诱导B细胞的分化并产生免疫球蛋白；促进T细胞的增殖生长；促进骨髓造血干细胞的增殖；增强血细胞的分化及其抗瘤效应等。并且现已确认是一种重要的促炎细胞因子，具有调节免疫应答、免疫期反应的作用，并参与机体炎症反应和抗感染的作用。研究表明，IL-6与临床呼吸系统疾病、肾脏疾病、肿瘤、妊娠期高血压等许多疾病有着广泛的联系。业已证明，在感染时，IL-6与多种细胞因子协同构成炎性细胞网络，参与创伤和多种炎症性疾病的病理过程，且IL-6能预测器官功能不全的发生和预后，已被研究人员和临床医生所认可，认为在感染性疾病中IL-6是比CRP更为敏感的诊断指标。相关文献报道肺炎患儿IL-6升高的原因可能是由于患儿的气管黏膜受到细菌或病毒侵袭后，局部黏膜的SIgA水平降低，导致局部黏膜的清除能力降低，使体内的细胞因子通过血液运输到达机体的各个部位，进而造成血清IL-6水平的增高。IL-6是否与机体的T、B淋巴细胞调节紊乱有关，尽管很多学者已通过大量的实验证实了细胞因子IL-6在小儿肺炎中的作用，但因小儿肺炎的发病机制较复杂，其中免疫学机制起着重要的作用，所以它们的确切作用还不够明确，深入探索其发病机制，为临床医务工作者提供肺炎患儿的诊断、治疗和预防等多方面的理论依据仍需要进行进一步的研究。目前用于检测IL-6的方法主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)。ELISA法采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或碱性磷酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但ELISA法的检测灵敏度较低，线性范围窄，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有IL-6免疫检测方法存在的问题，本专利技术提供一种可用于定量检测的一步均相IL-6检测试剂盒；本专利技术还提供一种一步均相IL-6检测试剂盒的制备方法和使用方法。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种一步均相IL-6检测试剂盒，主要组成包括：抗IL-6抗体偶联的发光微球、抗IL-6抗体偶联的感光微球、分析缓冲液、反应孔。所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子，发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或Thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，发光微球大小为100-300nm，该发光微球可由铂金埃尔默公司购得。所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，感光微球带有光激发产生单线态氧的染料，如酞箐染料、叶绿素等，感光微球大小为100-300nm，该感光微球可由铂金埃尔默公司购得。进一步地，所述抗IL-6抗体(通过常规免疫学方法制备)为针对IL-6不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。进一步地，所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管。本专利技术所述的一步均相IL-6检测试剂盒的制备方法，，包括如下步骤：(1)抗IL-6抗体偶联发光微球的制备；(2)抗IL-6抗体偶联感光微球的制备；(3)分析缓冲液的制备。进一步地，所述抗IL-6抗体偶联发光微球的制备，包括如下步骤：(1)将抗IL-6抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液洗涤，备用；将发光微球，用HEPES缓冲液清洗，离心，去除上清；(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；(3)加入2.0-3.0μl 10％质量分数Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，震荡反应24-48小时；(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反应体系中；震荡反应0.5-1.5小时，离心，去除上清；(5)加入150-250μl Tris-HCl缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；(6)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，使用前稀释至所需浓度。进一步地，所述抗IL-6抗体偶联感光微球的制备，包括如下步骤：(1)将抗IL-6抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液洗涤，备用；将感光微球，用HEPES缓冲液清洗，离心，去除上清；(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；(3)加入2.0-3.0μl 10％质量分数Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，震荡反应24-48小时；(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反应体系中；震荡反应0.5-1.5小时，离心，去除上清；(5)加入150-250μl Tris-HCl缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；(6)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，使用前稀释至所需浓度。进一步地，所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEPES 0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。进一步地，步骤(1)中所述抗IL-6抗体与发光微球与的质量比为1：(1-100)。进一步地，步骤(1)所述抗IL-6抗体与感光微球的质量比为1：(1-100)。进一步地，使用分析缓冲液稀释抗IL-6抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗IL-6抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。本专利技术所述的一步均相IL-6检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗IL-6抗体偶联的发光微球和抗IL-6抗体偶联的感光微球，混合反应5-60分钟；(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；(3)绘制IL-6浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算IL-6含量。有益效果：由现有技术相比，本专利技术的一步均相IL-6检测试剂盒具有如下优点：本专利技术所得试剂盒能利用IL-6的抗体，以氧通道化学发光技术为平台，针对脓毒血症诊断的IL-6快速检测，本专利技术的试剂盒检测快速准确、范围宽、灵敏度高、特异性好、重复性好、免清洗；同时本专利技术的试剂盒的制备方法简单，无污染，并且试剂盒使用方法操作简单，将其应用于感染的监测，可以提高脓毒血症诊断的准确率，便于临床检测使用，具有极大的市场价值本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种一步均相IL‑6检测试剂盒，其特征在于，主要组成包括：抗IL‑6抗体偶联的发光微球、抗IL‑6抗体偶联的感光微球、分析缓冲液、反应孔。
【技术特征摘要】
1.一种一步均相IL-6检测试剂盒，其特征在于，主要组成包括：抗IL-6抗体偶联的发光微球、抗IL-6抗体偶联的感光微球、分析缓冲液、反应孔。2.根据权利要求1所述的一步均相IL-6检测试剂盒，其特征在于，所述抗IL-6抗体为针对IL-6不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。3.根据权利要求1所述的一步均相IL-6检测试剂盒，其特征在于，所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管。4.权利要求1-3任一所述的一步均相IL-6检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)抗IL-6抗体偶联发光微球的制备；(2)抗IL-6抗体偶联感光微球的制备；(3)分析缓冲液的制备。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗IL-6抗体偶联发光微球的制备，包括如下步骤：(1)将抗IL-6抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液洗涤，备用；将发光微球，用HEPES缓冲液清洗，离心，去除上清；(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；(3)加入2.0-3.0μl 10％质量分数Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，震荡反应24-48小时；(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反应体系中；震荡反应0.5-1.5小时，离心，去除上清；(5)加入150-250μl Tris-HCl缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；(6)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，使用前稀释至所需浓度。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗IL-6抗体偶联感光微球的制备，包括如下步骤：(1)将抗IL-6抗体加入到超滤管中...
【专利技术属性】
技术研发人员：李明明，黄宝福，淳林，
申请(专利权)人：南京普朗医疗设备有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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