一种高灵敏度可回收纳米生物传感器及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种高灵敏度可回收纳米生物传感器及其制备方法与应用，该生物传感器是以纳米级石墨烯为载体，通过抗体与纳米级石墨烯之间形成肽键，将抗体负载在纳米级石墨烯上；制备时，将氧化石墨烯或羧基化石墨烯加入酸性缓冲溶液中，超声分散；加入偶联剂及催化剂，反应，离心分离，保留剩余固体I，加入到碱性缓冲溶液中，超声分散，再加入抗体，反应，离心分离，保留剩余固体II，加入到封闭液中，超声分散均匀后，继续反应1‑2小时，随后离心分离，保留剩余固体III，加入到碱性缓冲溶液中，超声分散均匀，保存。与现有技术相比，本发明专利技术生物传感器灵敏度高，与抗体结合牢固，检测效率高，经济成本低，检测下限可以达到100pg/ml以下，回收率99％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物传感器制造领域，涉及一种高灵敏度可回收纳米生物传感器及其制备方法与应用。
技术介绍
阿尔茨海默症是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，其患者脑中Tau蛋白总量多于正常人，因此，可通过检测患者脑脊液中Tau蛋白含量来诊断阿尔茨海默症。目前，在人类体液的蛋白质检测方面，免疫分析方法因其特异性和高选择性而得到了广泛应用。特别是酶联免疫分析法(ELISA)几乎是体液中蛋白质检验的唯一方法。因为体液中各种物质含量复杂，难以使用其他化学方法对特定的某一种目标蛋白进行检测。而抗体对抗原的特异性识别，可以使得抗体有效地从复杂的成分中识别并俘获抗原，对原料的前处理要求比较少，可以进行直接检验。基于这个原理的ELISA分析方法，理论上可以检测任何蛋白质。但是该方法在设计上存在以下缺陷：首先，是抗体被包覆在聚苯乙烯酶标板上的工艺问题，因为聚苯乙烯与抗体之间仅仅是分子间力吸附而不是化学连接，这使得抗体不能有效地附着在酶标板上；其次，ELISA需要一些清洗过程，在清洗的过程中，已经连接上去的抗体和抗原会再次掉落；最后，二抗和抗原的识别并不是一对一的，一个抗原有可能吸附多个二抗，而只有二抗才会提供信息，这就使得二抗的量只能大约指示抗原的量。上述问题都导致了ELISA的检测精度和重现度较低。故ELISA只能停留在实验室研究阶段，难以被临床应用。石墨烯是一种由碳原子构成的单层片状结构的新材料，具有非同寻常的导电性能、超出钢铁数十倍的强度和极好的透光性，可被广泛应用于电子科技、新能源及基因测序等领域。石墨烯还可以吸附和脱附各种原子和分子，在化学及生物等领域有许多潜在的应用。申请公布号为CN 102590309 A的中国专利技术专利公布了一种石墨烯晶体管及其生物传感器的制作与应用方法，该方法针对石墨烯晶体管传感器选择性较差的问题，提出了制作基于石墨烯晶体管的生物传感器的方法，该方法是在石墨烯晶体管表面生长氧化锌纳米线或金属纳米颗粒，而这些晶体管表面的纳米材料有利于吸附具有专一识別功能力的生物活性物质(如酶，DNA，RNA，适体，抗原或抗体等)，使得石墨烯晶体管通道具有选择性吸附目标分析物的能力，提高了基于石墨烯晶体管通道传感器的灵敏度和选择性。上述专利公布的技术方案中，晶体管表面的纳米材料表层通过静电作用吸附生物活性物质，通过吸附目标分析物后石墨烯的电阻特性变化来检测样本中的微量目标分析物。其中抗体和晶体管的这种吸附不具备特异性，只要是结构上具有和碳的六元环相似的物质都能被吸附，而且这种吸附是可逆的，这使得在运用中已经吸附的抗体容易被待测样品中的某些物质替换，从而影响检测精度。因此在实际应用上对待测样品的前处理要求很高。不同于上述专利，本专利技术是通过抗体与石墨烯之间形成肽键，来增强石墨烯对抗体的结合力，抗体结合效率更高更牢固，且采用免疫竞争反应检测样品的蛋白浓度，对抗体的要求较低，可以直接使用多克隆抗体代替单克隆抗体，降低了成本。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种灵敏度高、与抗体结合牢固，检测效率高，经济成本低的高灵敏度可回收纳米生物传感器及其制备方法与应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种高灵敏度可回收纳米生物传感器，该生物传感器是以纳米级石墨烯为载体，通过抗体与纳米级石墨烯之间形成肽键，将抗体负载在纳米级石墨烯上。所述的纳米级石墨烯的厚度≤0.9nm，长度≤100nm，宽度≤100nm。所述的抗体为单抗或多抗中的一种。所述的抗体包括但不限于Tau蛋白抗体。一种高灵敏度可回收纳米生物传感器的制备方法，该方法具体包括以下步骤：(1)将氧化石墨烯或羧基化石墨烯加入酸性缓冲溶液中，超声分散均匀；(2)再加入偶联剂及催化剂，反应1-12小时；(3)待反应结束后，离心分离，除去上层清液，保留剩余固体I；(4)将剩余固体I加入到碱性缓冲溶液中，超声分散均匀；(5)再加入抗体，反应1-8小时；(6)待反应结束后，离心分离，除去上层清液，保留剩余固体II；(7)将剩余固体II加入到封闭液中，超声分散均匀后，继续反应1-2小时，随后离心分离，除去上层清液，保留剩余固体III；(8)将剩余固体III加入到碱性缓冲溶液中，超声分散均匀，保存。步骤(2)中所述的氧化石墨烯或羧基化石墨烯与偶联剂、催化剂的质量比为1-5:1-10:1-10；步骤(5)中所述的抗体与氧化石墨烯或羧基化石墨烯的质量比为1-3:100000-500000。所述的酸性缓冲溶液包括MES(2-吗啉代乙磺酸)、MEST(2-吗啉代乙磺酸-吐温)、Bis-Tris(二(2-羟乙基)三亚氨基(羟甲基)甲烷)、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)、MOPS(3-吗啉丙磺酸)或甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种；所述的偶联剂为碳二亚胺类偶联剂，包括EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)，DCC(二环己基碳二亚胺)或DIC(N,N-'二异丙基碳二亚胺)中的一种；所述的催化剂包括NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)或DMAP(4-二甲氨基吡啶)中的一种；所述的碱性缓冲溶液包括TAE(三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸二钠，冰醋酸缓冲液)、TPE(三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸二钠，磷酸缓冲液)、tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、PBS(磷酸-磷酸盐缓冲液)或磷酸氢二钠-氢氧化钠中的一种；所述的封闭液包括BSA(牛血清蛋白)、HSA(人血清白蛋白)或明胶中的一种。所述的酸性缓冲溶液的pH为0-5，所述的碱性缓冲溶液的pH＞7。一种高灵敏度可回收纳米生物传感器的应用，所述的生物传感器基于免疫竞争反应用于检测包括Tau蛋白在内的人体体液蛋白质。本专利技术生物传感器中，抗体在纳米级石墨烯上的负载量由待测样品的估计浓度来确定。例如，人体待检测的Tau蛋白含量在0-1000pg/mL之间，那么抗体的负载量应为该浓度范围的0.5-2倍。本专利技术生物传感器制备方法的反应机理是经典的碳二亚胺偶联机理，具体反应机理的一种典型化学式为：上述化学反应式中，1代表氧化石墨烯或羧基化石墨烯，2代表抗体。氧化石墨烯或羧基化石墨烯的羧基与偶联剂发生反应，脱去羧基上的羟基基团，与偶联剂形成一个中间产物A；生成的中间产物A再与抗体反应，并生成产物B，即为所述的纳米生物传感器。以上化学式仅为一种典型的实施例，根据偶联剂及其稳定剂的不同，可以有一定的变化。本专利技术生物传感器在实际应用时，以免疫竞争反应代替二抗标记，具体步骤为：(a)将待检测蛋白的标准品按不同浓度配成10个样品；(b)分别加入一定量的抗体-石墨烯复合材料的溶液，培养0-2小时后，再分别加入一定量的带有荧光标记(包括但不局限于各种辣根类、异硫氰酸酯类荧光染料)的蛋白标准品并继续培养0-2小时；(c)采用步骤(b)对待测样品进行处理；(d)将培养结束后的蛋白标准品，使用荧光仪检测荧光强度，并重复5-10次，绘制浓度-荧光强度标准曲线；(e)将待测样品的荧光强度与浓度-荧光强度标准曲线进行拟合，即可计算出待测样品中的蛋白浓度。本专利技术采用纳米级石墨烯作为载体，结合免疫识别、荧光共振技术，构建了一种超灵敏，高选择性，低检测下限的纳米生物传感体系，所采用的制备方法是独创的有别于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高灵敏度可回收纳米生物传感器，其特征在于，该生物传感器是以纳米级石墨烯为载体，通过抗体与纳米级石墨烯之间形成肽键，将抗体负载在纳米级石墨烯上。

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏度可回收纳米生物传感器，其特征在于，该生物传感器是以纳米级石墨烯为载体，通过抗体与纳米级石墨烯之间形成肽键，将抗体负载在纳米级石墨烯上。2.根据权利要求1所述的一种高灵敏度可回收纳米生物传感器，其特征在于，所述的纳米级石墨烯的厚度≤0.9nm，长度≤100nm，宽度≤100nm。3.根据权利要求1所述的一种高灵敏度可回收纳米生物传感器，其特征在于，所述的抗体为单抗或多抗中的一种。4.根据权利要求3所述的一种高灵敏度可回收纳米生物传感器，其特征在于，所述的抗体包括但不限于Tau蛋白抗体。5.如权利要求1所述的一种高灵敏度可回收纳米生物传感器的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：(1)将氧化石墨烯或羧基化石墨烯加入酸性缓冲溶液中，超声分散均匀；(2)再加入偶联剂及催化剂，反应1-12小时；(3)待反应结束后，离心分离，除去上层清液，保留剩余固体I；(4)将剩余固体I加入到碱性缓冲溶液中，超声分散均匀；(5)再加入抗体，反应1-8小时；(6)待反应结束后，离心分离，除去上层清液，保留剩余固体II；(7)将剩余固体II加入到封闭液中，超声分散均匀后，继续反应1-2小时，随后离心分离，除去上层清液，保留剩余固体III；(8)将剩余固体III加...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄奡，姚天明，石硕，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31