本发明专利技术公开了一种简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒及其使用方法，包括标记有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、细胞裂解液、链霉亲和磁珠、洗液和蛋白洗脱液。本发明专利技术用RNA去抓与之相互作用的蛋白质，首先把已知序列的RNA做好标记（例如biotin),依靠这个标记将RNA固定到某Beads上，再和含有蛋白的物质共孵育，之后去掉未与RNA作用的上清收集从Beads上洗下来的蛋白，得到的蛋白可做质谱或免疫印迹实验。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物领域，尤其涉及一种简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
非编码RNA是众多细胞过程的关键调控子，对维持细胞内稳态非常关键，与发育和癌症进程密切相关。非编码RNA主要包括长非编码RNA(lncRNA)和microRNAs(miRNA)，它们可以调节转录因子的表达、指导染色质的重组和修饰、减少mRNA的翻译对基因表达进行控制。RNA结合蛋白(RNA-binding proteins)在转录后基因表达调节中起着重要的作用,它通过和RNA相互作用来调节细胞的功能。RNA结合蛋白参与RNA剪接、多聚腺苷化作用、序列编辑、RNA转运、维持RNA的稳定和降解、细胞内定位和翻译控制等RNA代谢的各个方面。RNA结合蛋白根据结构或功能的不同可分为核糖核蛋白（RNP）、KH基序RNA结合蛋白、双螺旋RNA结合蛋白和冷酸基序RNA结合蛋白RNA结合蛋白质包括异源核糖核蛋白、小核糖核蛋白、Poly（A）结合蛋白、叶绿体RNA结合蛋白、植物富含甘氨酸RNA结合蛋白、哺乳动物富含甘氨酸RNA结合蛋白和蓝细菌RNA结合蛋白。蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。了解它们之间相互作用的分子机制对理解这些生物学过程非常重要。然而，之前的分析方法往往受限于使用放射性标记，或实验步骤过多，不仅耗时费力，也增加了实验结果的不稳定。另外，稳定的实验体系也需要耗费较长时间建立。许多研究者不确定实验的阴性、阳性。综上所述，本领域中没有特别稳定且省时的方法检测RNA与蛋白的相互作用。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性好、经济、完整的简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒及其使用方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：一种简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒，包括标记有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、细胞裂解液、链霉亲和磁珠、洗液和蛋白洗脱液。本专利技术用RNA去抓与之相互作用的蛋白质，首先把已知序列的RNA做好标记（例如biotin), 依靠这个标记将RNA固定到某Beads上，再和含有蛋白的物质（ 例如细胞裂解物）共孵育，之后去掉未与RNA作用的上清 收集从Beads上洗下来的蛋白，得到的蛋白可做质谱或免疫印迹实验。进一步地，所述细胞裂解液的配方包括如下原料：0.05~1.5体积% NP-40；0.15~0.35体积% 去氧胆酸钠； Tris-HCL 45~55 mmoL/L ；Nacl 140~160 mmoL/L；EDTA 0.8~1.2 mmoL/L；PMSF 0.8~1.2mmoL/L；所述Tris-HCL的pH值为7.2~7.5。其中，NP-40是一种去垢剂，可以裂解胞膜，0.25%左右的去氧胆酸钠可以裂解细胞膜；去氧胆酸钠是一种离子型去垢剂，可以裂解胞膜，0.25%左右的去氧胆酸钠可以裂解细胞膜，0.5%的去氧胆酸钠可以裂解核膜；Tris-HCL作为一种缓冲液，可以维持稳定的pH值，pH值为7.2~7.5，与细胞正常PH值（7.4左右）保持一致,保持正常的DNA和蛋白形态；Nacl作为一种电解质，协调细胞内外的离子浓度；EDTA为乙二胺四乙酸，可以和金属离子络合，作为核酸酶和蛋白酶的抑制剂；PMSF为磷酸酶抑制剂，主要抑制磷酸酶的活性。所述洗液的配方包括如下原料：Tris-HCL 45~55 mmoL/L；EDTA 0.8~1.2 mM；KCl 80~120 mM；0.1~0.2体积% TritonX-100；0.05~0.15体积%甘油；4.5~5.5体积% DTT；所述Tris-HCL的pH值为6.8~7.2。其中，KCl作为一种电解质，可以协调细胞内外的离子浓度；TritonX-100为一种去垢剂，0.1%以上的TritonX-100可以去除大部分脂类物质；少量的，即1%左右的甘油可以结合大量分子，稳定蛋白的结构，降低蛋白的降解；DTT是一种还原剂，5%左右可以稳定蛋白的活性。蛋白的外界环境一般是中性，PH=7.0左右，所以所述Tris-HCL的pH值调为6.8~7.2。所述蛋白洗脱液的配方包括如下原料：220~280 mM Tris-HCl；8.5~11.5%（W/V）SDS；0.2~0.6%（W/V）溴酚蓝；45~55%（V/V）甘油；4~6%（W/V）β-巯基乙醇；所述Tris-HCL的pH值为6.6~7.0。其中，10%左右的SDS可以使蛋白变性，并使蛋白均匀带负电荷；溴酚蓝为指示剂，电泳时指示蛋白条带的位置；甘油可增加溶液的粘稠度，上样后，使液体更容易沉淀；5%左右的β-巯基乙醇可以使蛋白变性；蛋白带负电荷，溶液的PH值应保持在偏酸性，所以所述Tris-HCL的pH值调为6.6~7.0。所述简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：S1、制备标记生物素RNA探针：以含有目的基因的T载体为模板，标记有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP为底物，通过T7RNA聚合酶经体外转录标记RNA；S2、制备细胞蛋白提取液：S21、将3~5×107个细胞收集至1.5ml离心管中；S22、加0.5~1ml细胞裂解液，再加入10~20U/ml RNase inhibitor和0.5~1ug/ml的蛋白酶抑制剂，裂解细胞 ，取上清作为蛋白提取液；S3、链霉亲和磁珠与标记生物素RNA探针孵育：将步骤S1制备的RNA探针与链霉亲和磁珠孵育，使RNA探针结合到链霉亲和磁珠上，用洗液洗掉未结合磁珠；S4、标记RNA探针的磁珠与蛋白提取液孵育，富集RNA结合蛋白，得到蛋白：将S3制备的含有RNA探针的磁珠与细胞裂解液或纯蛋白孵育，用洗液洗掉未结合蛋白，加洗脱液洗脱结合蛋白。步骤S1的具体步骤为：依次加入线性化DNA片段1~2ug、Biotin RNA labeling mix 2ul、10X buffer 2ul、T7 RNA 聚合酶 2ul，加水补足18ul，在温度为37℃条件下孵育2~3h，进行反转录，并标记此RNA；再加1.5~2ul DNase I，在温度为37℃条件下孵育15~20min，然后加2~2.5ul 0.2M EDTA，调至pH=7.5~8.0； 95℃条件下加热2min，冰浴3min，室温静置30min，去除DNA。步骤S3包括如下步骤：先采用500ul~700 ul Wash Buffer 冲洗50ul链霉亲和磁珠3~5 次，再将步骤S1标记的RNA加入链霉亲和磁珠，在温度4℃条件下过夜孵育；然后，在转速为3000~5000rpm条件下离心1~2min，去上清液，最后用Wash buffer I 洗3~5次。步骤S4包括如下步骤：向S3制备的含有RNA探针的磁珠磁珠中加入1~2mg蛋白提取液，在温度4℃条件下孵育4h；再在转速为3000~5000rpm条件下离心1~2min，去上清液；然后用Wash buffer I 洗3~5次后加30~50ul 蛋白洗脱液，在转速为12000rpm条件下离心，取上清液。本步骤中，蛋白提取液最多加入2mg蛋白，蛋白过量后，会增加磁珠的非特异性结合，一定要在4℃条件下孵育，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒，其特征在于，包括标记有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、细胞裂解液、链霉亲和磁珠、洗液和蛋白洗脱液。
【技术特征摘要】
1.一种简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒，其特征在于，包括标记有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、细胞裂解液、链霉亲和磁珠、洗液和蛋白洗脱液。2.根据权利要求1所述简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述细胞裂解液的配方包括如下原料：0.05~1.5体积% NP-40；0.15~0.35体积% 去氧胆酸钠；Tris-HCL 45~55 mmoL/L ；Nacl 140~160 mmoL/L；EDTA 0.8~1.2 mmoL/L；PMSF 0.8~1.2mmoL/L；所述Tris-HCL的pH值为7.2~7.5。3.根据权利要求1所述简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述洗液的配方包括如下原料：Tris-HCL 45~55 mmoL/L；EDTA 0.8~1.2 mM；KCl 80~120 mM；0.1~0.2体积% TritonX-100；0.05~0.15体积% 丙三醇；4.5~5.5体积% DTT；所述Tris-HCL的pH值为6.8~7.2。4.根据权利要求1所述简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述蛋白洗脱液的配方包括如下原料：220~280 mM Tris-HCl；8.5~11.5体积%（W/V）SDS；0.4~0.6体积%（W/V）溴酚蓝；45~55%（V/V）甘油；4~6%（W/V）β-巯基乙醇；所述Tris-HCL的pH值为6.6~7.0。5.根据权利要求1~4任意一项所述简便检测RNA与蛋白互作的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备标记生物素RNA探针：以含有目的基因的T载体为模板，标记有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP为底物，通过T7RNA聚合酶经体外转录标记RNA；S2、制备细胞蛋白提取液：S21、将3~5×107个细胞收集至1.5ml离心管中；S22、加0.5~1ml细胞裂解液，再加入10~20U/ml RNase inhibitor和0.5~1ug/ml的蛋白酶抑制剂，裂解细胞 ，取上清作为蛋白提取液；S3、链霉亲和磁珠与标记生物素R...
【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，钱智鹏，乔继彪，张映菲，张余琴，
申请(专利权)人：高飞，
类型：发明
国别省市：广东;44
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