本发明专利技术涉及一种用于肝癌检测的试剂盒。维甲酸诱导蛋白RAI16在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质。现有技术的检测方法具有一定的局限性，不适宜廉价的大面积推广。本发明专利技术提供的试剂盒能够通过检测组织中蛋白的含量来鉴定时候患有肝癌，从而能够快速高效的检测肝癌。所述检测成本低廉，易于推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于肝癌检测的试剂盒。
技术介绍
肝脏是人的主要消化器官，因不注意饮食卫生，它容易导致各种疾病，如各种肝炎、肝腹水、肝硬化等，特别是肝癌，对人类的危害更大，很多时候人体并没有觉察，没有疼痛感，当感觉到疼痛时已经进入了肝癌的晚期很难治疗，给病人带来很大的痛苦。原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是严重威胁人类生命健康的疾病。肝细胞癌恶性程度高，容易复发和转移，预后差，而且早期诊断较困难，往往延误了最佳治疗时期。我国是肝癌高发国家，每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45％。发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌严重危害我国人民生命财产安全，并且是影响社会经济发展的一个重要因素。肝癌的及早发现和确诊对于提高患者的生存率至关重要，而目前广泛采用检测血清中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)来确诊HCC,其敏感性、特异性及准确性均不理想，尤其对肿瘤直径小于3cm的小肝癌患者，其敏感性及阳性率更低，仅分别为和(AFP>20ug/L)。近年来已有20余种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因、尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。维甲酸诱导蛋白RAI16(Retinoic acid induced protein 16)的NCBI登录号为NP_073586.5，Swissprot登录号为Q86V87，IPI号为IP100654780.2。维甲酸诱导蛋白RAI16是维甲酸诱导产生的蛋白分子，其结构与功能目前尚未清楚。维甲酸诱导蛋白RAI16最初是在维甲酸诱导细胞分化时分离出来的，而维甲酸具有抑制细胞增殖、促进细胞调亡和促进细胞分化的作用，已被应用于急性淋 巴细胞白血病、肺癌及肝癌等多种癌症的治疗。现有技术已经发现维甲酸诱导蛋白RAI16在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中上调表达)。因此，检测RAI16即可实现对肝脏疾病的判断。但是现有技术中，蛋白的检测通常采用抗体的方法，由于抗体制备复杂，成本较高，因此，在检测中并不适合廉价的推广。核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异结合RAI16的核酸适体及其试剂盒。本专利技术提供的核酸适体，是序列表的序列1-23所示的单链DNA。所述核酸适体与RAI16蛋白具有较好的亲和能力。还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。所述核酸适体可用于制备检测RAI16的试剂盒。利用本专利技术的核酸适体，可以捕获血液中的RAI16，从而用于脑血管病筛查。利用本专利技术的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获RAI16进行检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本专利技术具有很高的应用价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、蛋白的制备以及核酸适体的筛选和制备一.蛋白的制备根据已有的维甲酸诱导蛋白RAI16的序列NP_073586.5，获得相应的基因序列，利用CN 1318594 C中实施例1的真核表达蛋白的方法，进行蛋白的表达，采用常规的蛋白纯化方法得到纯化的蛋白，浓度为100mg/ml,4度储存备用。二、适配体的制备设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括35个核苷酸的随机核酸文库如下：5‘-TGCAAGCAGTGACGAAGATC(N35)GGACAGTTGAAAGTTGACGA-3’；N35代表35个随机核苷酸。将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug RAI16蛋白，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出适配子库，筛选共进行13轮。得到了23个适配子，其序列分别为SEQ ID NO:1-23所示。具体序列如下所示：RAI16-1:TGCAAGCAGTGACGAAGATCAATATTCATCTCCTAATCACAATTCTCCATTTCTTGGACAGTTGAAAGTTGACGARAI16-2:TGCAAGCAGTGACGAAGATCCAAATTCTTCCAACCTTACCTTCCAAACATCCCCCGGACAGTTGAAAGTTGACGARAI16-3:TGCAAGCAGTGACGAAGATCTATACAAATATTCCCAAAATTTCCATATTTATATAGGACAGTTGAAAGTTGACGARAI16-4:TGCAAGCAGTGACGAAGATCAACCACAAAACTTCATCCAATACTCAACCTTTTAAGGACAGTTGAAAGTTGACGARAI16-5:TGCAAGCAGTGACGAAGATCTCCTTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于：含有能特异性检测RAI16蛋白的核酸适体。
【技术特征摘要】
1.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于：含有能特异性检测RAI16蛋白的核酸适体。2.如权利要求1的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体序列如SEQ ID...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹帅，
申请(专利权)人：曹帅，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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