提供了用于分离和检测产生分泌的异二聚体目标蛋白(POI)的细胞的重组的细胞表面捕捉蛋白和检测分子，所述POI具有免疫球蛋白CH3结构域和/或经置换的CH3结构域。还提供了分离和检测双特异性抗体的重组的细胞表面捕捉蛋白和检测分子。本发明专利技术还提供了能够识别和结合目标蛋白的重组的抗原结合蛋白，所述目标蛋白包含CH3结构域和/或经修饰的CH3结构域，例如在H95和Y96(IMGT)上具有或不具有氨基酸置换的CH3结构域。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】重组的细胞表面捕捉蛋白 背景 相关申请的交叉参考 本申请要求2012年11月14日提交的美国临时专利申请No. 61/726,040的35 USC§ 119(e)下的利益，所述申请特别地通过引用整体并入本文。 序列表 本申请通过引用并入以计算机可读形式提交为创建于2013年11月12日的文件 8600W0_ST25.txt(86, 267 字节）的序列表。 专利
本专利技术的领域涉及用于鉴定、分离和富集产生分泌的蛋白的细胞的重组的细胞表 面捕捉蛋白和方法，所述分泌的蛋白是异二聚体例如双特异性蛋白。更具体地，所述细胞表 面捕捉蛋白和方法允许快速有效地分离高表达重组抗体产生细胞系，包括快速有效地分离 分泌异二聚体蛋白例如双特异性抗体的特定杂交瘤和细胞，从而富集异二聚体种类（双特 异性分子）并优选从同二聚体种类分离异二聚体。 用于在宿主细胞中表达目的基因（G0I)的现有技术方法是已知的。简要地，将携 带G0I的表达载体引入所述细胞中。在稳定整合后，用于分离高表达细胞的标准方法包括 细胞库的收集、从平板手选菌落、通过有限稀释分离单个细胞或本领域中已知的其它方法。 随后扩增库或个体克隆并通过直接测量目的蛋白（P0I)活性、通过免疫检测P0I或通过其 它适当的技术来针对P0I的产生进行筛选。这些程序是费力、低效、昂贵的，并且可被分析 的克隆的数量通常限于数百个。 细胞在稳定整合后的蛋白表达中的高度异质性需要将许多个体克隆进行筛选以 鉴定稀少的导致稳定的高表达产生细胞系的整合事件。此需要要求使得能够快速鉴定和分 离表达最高水平的蛋白产生的细胞的方法。此外，克隆库的收集或手选的菌落冒着丢失通 常生长得较为缓慢的高表达细胞至更快生长的低表达细胞的风险。因此，存在对于允许快 速筛选和分离能够高水平表达分泌的P0I的个体细胞的方法的需求。当P0I包含多于一个 亚基时，需要优选地相对于同二聚体种类选择期望的异二聚体种类。 在用于分离稳定表达细胞系的方法中并入流式细胞术已改善了筛选大量个体克 隆的能力，然而，目前可用的方法因多种原因而仍然是不适当的。具有不同特征的细胞之间 的P0I扩散也是一个问题。 概述 本专利技术描述了用于通过直接筛选目标蛋白（P0I)来快速分离分泌蛋白的那些细 胞的高通量筛选方法。本专利技术还允许在生产过程中在单细胞基础上方便地监测P0I表达。 此外，此技术可直接地应用于筛选产生双特异性抗体的细胞或产生异二聚体蛋白的任何细 胞。所述技术还可直接地应用于筛选产生经修饰的T细胞受体的细胞，例如产生T细胞受 体的可溶性形式的细胞。 在一个方面，本专利技术提供了检测和分离产生分泌的目标蛋白（P0I)的细胞的方 法，其包括：a)构建编码能够结合POI的细胞表面捕捉分子的核酸分子；b)用步骤a)的核 酸分子转染表达所述P0I的细胞；c)通过使所述细胞与检测分子接触来检测呈现在表面的 P0I，其中所述检测分子结合所述P0I;和d)基于所述检测分子分离细胞。 在多个实施方案中，目标蛋白包括配体、可溶性受体蛋白、生长因子、融合蛋白、 抗体、双特异性抗体、Fab、单链抗体（ScFv)或其片段。当所述目标蛋白是抗体时，抗体选 自IgM、IgG、IgA、IgD或IgE，以及这些的各种亚型或变体。在具体的实施方案中，抗体是 抗-DII4抗体，抗-ErbB3抗体，抗-EGFR抗体，双特异性的抗-ErbB3/EGFR双特异性抗体， 或抗-IL-6受体抗体。 在更具体的实施方案中，目标蛋白是生长因子，其选自白细胞介素（IL)-l、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、睫状神经 营养因子（CNTF)、红细胞生成素、血管内皮生长因子（VEGF)、血管生成素l(Ang-l)、血管生 成素 2 (Ang-2)、TNF、干扰素-y、GM-CSF、TGF0 和TNF受体。 在多个实施方案中，目标蛋白包含T细胞受体的可变结构域。在具体的实施方案 中，目标蛋白是可溶性T细胞受体（sTCR)或包含融合至Fc的T细胞受体胞外结构域的蛋 白（TCR-Fc)，在具体的实施方案中，所述Fc是人Fc。在多个实施方案中，所述蛋白包含T 细胞受体胞外结构域的可变结构域。在多个实施方案中，所述蛋白包含T细胞受体胞外结 构域的可变结构域和恒定区。 编码目标蛋白的核酸可以来自任何来源（天然存在的或通过重组技术构建的）， 并且可以选择自DNA文库。 在多个实施方案中，所述细胞表面捕捉分子是配体特异性受体、受体特异性配体、 抗体结合蛋白、抗体或抗体片段例如ScFv或者是肽。当捕捉分子是肽时，所述肽可分离自 噬菌体展示文库。在更具体的实施方案中，捕捉分子可以是Angl、Ang2、VEGF、Tiel、Tie2、 VEGFRI(Fltl)、VEGFRII(Flkl或KDR)、CNTF、CNTFR-a、细胞因子受体组分、两种或更多种 细胞因子受体组分的融合体或其片段。当捕捉分子是抗体结合蛋白时，所述抗体结合蛋白 可以是Fc受体、抗-免疫球蛋白抗体、抗-免疫球蛋白（抗-Ig)ScFv、抗-Fc抗体、抗-Fc* 抗体、蛋白A、蛋白L、蛋白G、蛋白H或其功能性片段。如此，在一些实施方案中，捕捉分子是 包含融合至跨膜结构域或GPI接头的抗原、蛋白A或抗-IgScFv的融合蛋白。在其中目标蛋白包含T细胞受体可变结构域的多个实施方案中，所述细胞表面捕 捉分子包含能够被所述T细胞受体的可变结构域识别的Fc受体或膜相关抗原。 在其中目标蛋白是异二聚体蛋白例如具有第一亚基和第二亚基的异二聚体蛋白 的一些实施方案中，所述细胞表面捕捉分子包含能够结合所述第一亚基而不结合所述第二 亚基的抗原、蛋白A或ScFv，或者这样的细胞表面捕捉分子结合所述第二亚基而不结合所 述第一亚基。 在其中目标蛋白是IgGl、IgG2、IgG4或具有一个包含废除与蛋白A的结合的突 变的CH3结构域和另一个能够结合蛋白A的CH3结构域的双特异性抗体；或者是包含来自 IgGl、IgG2、IgG4的Fc区或具有一个包含废除与蛋白A的结合的突变的CH3结构域和另一 个能够结合蛋白A的CH3结构域的Fc区的融合蛋白的多个实施方案中，所述细胞表面捕捉 分子包含抗-免疫球蛋白ScFv例如抗-Fc或抗-Fc*ScFv。 在几个实施方案中，本专利技术的方法还包括用于将P0I锚定至细胞膜、暴露于细胞 外部并因而用作细胞表面捕捉分子的膜锚定物。在具体的实施方案中，所述膜锚定物是跨 膜锚定物或GPI连接。具体的跨膜锚定物的实例包括Fc受体的跨膜结构域，例如人FcYRI 的跨膜结构域，其实例示于SEQIDNO: 17中。膜锚定物可以是对于细胞为天然的、重组的 或合成的。 在多个实施方案中，目标蛋白包含T细胞受体可变区，并且细胞表面捕捉分子包 含膜相关抗原。在具体的实施方案中，膜相关抗原是包含融合至膜锚定物的能够被T细胞 受体可变区识别的抗原的重组融合蛋白，其中所述抗原与细胞表面结合。在具体的实施方 案中，所述重组融合蛋白包含融合至跨膜锚定物或GPI连接的抗原。在另一个具体的实施 方案中，细胞表面捕捉分子包含重组融合蛋白，其包含膜锚定物和能够本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组的抗原结合蛋白，其结合人IgG1‑Fc结构域、人IgG2‑Fc结构域或人IgG4‑Fc结构域。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·德施潘德，陈刚，D·布拉科夫，J·凡德尔，T·奥尔德里奇，V·卡马特，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。