一种利用超疏水表面结晶蛋白质的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用超疏水表面结晶蛋白质的方法，该方法是在超疏水表面滴加蛋白质溶液，然后在密闭容器中使蛋白质溶液中的水缓慢挥发，蛋白质浓度逐渐增大最终达到其结晶的浓度，析出结晶并生长。本发明专利技术方法能够快速有效的得到蛋白质晶体(如溶菌酶可在几小时内完成结晶)，且极大地降低了蛋白质结晶所需浓度；另外，本发明专利技术结晶蛋白质的方法不需要加入有毒的沉淀剂(如2-甲基-2,4-戊二醇、苯甲基磺酰氯等有毒物质)，温和环保，且具有可控性，可通过滴加不同蛋白质溶液的体积得到不同尺寸的晶体，适用于大规模蛋白质结晶的生产。本发明专利技术操作简单，快速，温和，具有潜在的生物医药前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质的结晶方法
，具体设及一种利用超疏水表面结晶蛋白 质的方法。
技术介绍
由于生物大分子很难在体外保持其特有的完整生物活性，所W，有关于如何富集 该类分子并获得基本完整的生物活性的研究一直在进行。近年来，越来越多的试验证明，W 晶体结构存在的生物大分子是比较稳定的。 蛋白质的结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化的过程，即在溶液中处 于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固体。蛋白质分子的结晶过程一般分为Ξ个阶 段：（1)成核过程，W溶液的过饱和度为推动力使蛋白质分子有序排列，形成特定大小（临 界尺寸）的晶核；（2)晶体生长，分子不断的结合到形成的晶核上继续生长；（3)生长停止， 固-液相间的扩散交换达到动态平衡，晶体宏观上表现为停止生长。Ξ个阶段按顺序贯穿 整个结晶过程，缺一不可，而且各个阶段之间并没有明显的界限划分。但由于蛋白质的相 对分子质量很大，空间结构复杂，其表面常带有电荷，并且分子间一般都存在较多的结合位 点，相对于一些小分子的结晶，蛋白质大分子结晶所设及的情况更为复杂，一般小分子的结 晶方法并不适用于大分子的晶体生长，使得生物大分子的晶体培养工作相当困难。 一般培养蛋白质结晶的方法有：批量结晶、蒸发扩散结晶、液/液扩散结晶。批量 结晶是最古老和最简单的蛋白质结晶方法，它将所要结晶的蛋白质与结晶剂按要求的浓度 在实验开始时就混合起来W达到所要的过饱和度，使蛋白质结晶析出长大。气相扩散法分 为悬滴法和座滴法两种，其原理是将含有高浓度蛋白质的溶液加入适当的溶剂，随着水分 蒸发，蛋白质的浓度逐渐增大，并达到最适合结晶的水平，当整个系统处于平衡状态时，晶 体形成并在动态平衡中长大。液/液扩散结晶又叫自由界面结晶，其利用浓度梯度使位于 毛细管中的结晶液和外部的缓冲溶液在界面处发生自由扩散，使蛋白质溶液过饱和并结晶 出来。但是，运些制备蛋白质结晶的方法都存在一定的局限性：①在蛋白质溶液中有时需要 加入有毒的沉淀剂，不适于生命过程的研究，如β-酬脂酷-ACP合成酶等晶体的制备，通常 需加入2-甲基-2, 4-戊二醇、苯甲基横酷氯等剧毒物质；②成本较高且制备晶体周期长，如 蒸发扩散结晶需要购买昂贵的试剂盒来确定最佳结晶条件。③要求结晶的蛋白质的浓度都 较高且许多蛋白质不易结晶，运对于较难提取，或较为昂贵的蛋白质的进一步分析研究不 利，如膜蛋白的结晶。 因此，到目前为止，已经获得成功并能得到质量优异的蛋白质晶体数目仍相对较 少，总的生物大分子获得优质结晶体的统计数目也有待于增加，获得质量完美的蛋白质晶 体成为蛋白质结构测定的主要瓶颈，需要探索新的结晶方法W制备蛋白质等生物大分子晶 体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种利用超疏水表面快速结晶蛋白质的方 法。 阳007] 解决上述技术问题所采用的技术方案是：将包含蛋白质的缓冲液滴加到具有超疏 水表面的基材上，在密闭容器中加入缓冲液，然后将基材置于盛有缓冲液的密闭容器上方， 4~40 °C放置至晶体析出。 上述的蛋白质为溶菌酶、β-酬脂酷-ACP合成酶、刀豆蛋白A、牛血清蛋白等中的 任意一种，其中溶菌酶来源物种为人、鸡、牛、鼠或骆驼，刀豆蛋白A来源于刀豆，均由西格 玛奥德里奇（上海）贸易有限公司提供，β-酬脂酷-ACP合成酶来源于结核杆菌。 上述蛋白质为溶菌酶且溶菌酶的质量-体积浓度为20~lOOmg/mL时，不需要加 入沉淀剂，只需将仅含溶菌酶的缓冲液滴加到具有超疏水表面的基材上，在密闭容器中加 入缓冲液，然后将基材置于盛有缓冲液的密闭容器上方，4~25°C放置至晶体析出；其中蛋 白质为溶菌酶或β-酬脂酷-ACP合成酶，且蛋白质的质量-体积浓度为0. 5~20mg/mL 时，为了节省结晶时间，可加入沉淀剂，即将包含蛋白质和沉淀剂的缓冲液滴加到具有超疏 水表面的基材上，在密闭容器中加入缓冲液，然后将基材置于盛有缓冲液的密闭容器上方， 4~25°C放置至晶体析出；其中蛋白质为刀豆蛋白A或牛血清蛋白，且蛋白质的质量-体积 浓度为5~80mg/mL时，同样为了节省结晶时间，将包含蛋白质和沉淀剂的缓冲液滴加到具 有超疏水表面的基材上，在密闭容器中加入缓冲液，然后将基材置于盛有缓冲液的密闭容 器上方，25~40°C放置至晶体析出。 上述具有超疏水表面的基材是表面具有微纳尺度溶菌酶相转变产物的基材或表 面具有微纳尺度铜的基材或表面具有微纳尺度Si化的基材。 上述表面具有微纳尺度溶菌酶相转变产物的基材根据申请号为20150282788. 4、 专利技术名称为"蛋白质自组装构筑超疏水表面的方法"的专利技术专利申请中的方法制备而成，具 体制备方法为：将含溶菌酶的肥PES缓冲液和含Ξ(2-簇乙基）麟的肥PES缓冲液等体积混 合后用化0H调节抑值为6. 0~10. 0,所得混合液中溶菌酶的浓度为2~5mg/mL，Ξ(2-簇 乙基）麟的浓度为20~30mmol/L;将所得混合液滴加到基材表面，在潮湿环境中室溫培养 1~2小时，然后将基材表面用超纯水清洗干净，真空干燥，得到负载微纳结构溶菌酶相转 变产物的基材；在负载微纳结构溶菌酶相转变产物的基材上修饰低表面能物质，其中所述 的低表面能物质为全氣辛酷氯、全氣十二烷基Ξ氯硅烷、1H，1H，2H，2H-全氣辛基Ξ氯硅烷、 4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7, 8, 8, 9, 9, 10, 10, 11, 11, 11-十屯氣^--酷氯、十八碳酷氯、十六碳酷氯中 的任意一种，得到表面具有微纳尺度溶菌酶相转变产物的基材。 上述表面具有微纳尺度铜的基材根据申请号为20150282788. 4、专利技术名称为"蛋 白质自组装构筑超疏水表面的方法"的专利技术专利申请中的方法制备而成，具体制备方法为： 将 50血含有 50mmol/L邸TA、50mmol/LCuS〇4、0.Imol/L棚酸的水溶液用Imol/L化0H水 溶液调节抑值至7. 0后，将负载微纳结构溶菌酶相转变产物的基材浸入其中，再加入50mL 0.Imol/L二甲胺棚烧（梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）水溶液，30°C反应3小时， 得到表面具有微纳尺度铜的基材。 上述表面具有微纳尺度Si〇2的基材根据"Mussel-inspiredSurfaceQiemistry forMultifunctionalCoatings"狂uDeng，DorisVollmer等，2012，Science)中的方法 制备而成，具体制备方法为：将基材放置在蜡烛上方，点燃蜡烛几分钟，即得到负载微纳结 构碳黑的基材；将负载微纳结构炭黑的基材置于干燥器中，并在干燥器中放置盛有四乙氧 基硅烷和氨水的体积比为1:1的混合液的小烧杯，24小时后炭黑表面沉积上一层Si〇2,然 后将该基材置于马弗炉中600°C般烧2小时，炭黑被烧掉，得到表面只有微纳结构Si化层的 基材，再将该基材置于盛有1H，1H，2H，2H-全氣辛基Ξ氯硅烷的密闭容器上方，室溫真空密 闭放置3小时，得到表面具有微纳尺度Si化的基材。 上述基材为娃片、玻璃、化片等中的任意一种；缓冲液是醋酸钢缓冲液、巧樣酸钢 缓冲液、Tris-HCl缓冲液、肥阳S缓冲液、憐酸盐缓冲液等中的任意一种，其抑值为4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用超疏水表面结晶蛋白质的方法，其特征在于：将包含蛋白质的缓冲液滴加到具有超疏水表面的基材上，在密闭容器中加入缓冲液，然后将基材置于盛有缓冲液的密闭容器上方，4～40℃放置至晶体析出。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨鹏，高爱婷，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61