纯化疏水蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及疏水蛋白的回收和/或纯化工艺，所述工艺涉及有机溶剂，但不需要分离技术。具体地讲，本发明专利技术涉及用于疏水蛋白II的选择性醇沉淀的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及疏水蛋白的回收和/或纯化工艺，所述工艺涉及有机溶剂，但不需要分离技术。具体地讲，本专利技术涉及用于疏水蛋白II的选择性醇沉淀的方法。【专利说明】 相关专利申请并以引用的方式并入该专利申请要求提交于2011年4月15日的美国临时专利申请N0.61/475，933的优先权。引用以下国际专利申请:提交于2009年6月9日的国际专利申请N0.PCT/US2009/046783,作为 PCT 公开 N0.W02009/152176 公布于 2009 年 12 月 17 日；提交于 2010年8月10日的国际专利申请N0.PCT/US2010/044964，作为PCT公开N0.WO 2011/019686公布于2011年2月17日；提交于2010年8月10日的国际专利申请N0.PCT/US2010/044964 ；以及提交于2012年3月29日的国际专利申请N0.PCT/US12/31104。上述专利申请和其中引用的或在申请过程中的所有文献(“专利申请引用文献”)、专利申请引用文献中引用或提及的所有文献、本文引用或提及的所有文献(“本文引用文献”)以及本文引用文献中引用或提及的所有文献，连同本文中或以引用方式并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的指示、说明、产品规格和产品表均据此以引用方式并入本文中，并可以用于本专利技术操作。更具体地讲，所有引用的文献均以相同的程度以引用方式并入，如同指示每个单独的文献具体地和单独地以引用方式并入。
本专利技术涉及包含有机溶剂的疏水蛋白的回收和/或纯化工艺，该工艺不需要分离技术。专利技术背景疏水蛋白是约100至150个氨基酸的小蛋白，其出现在丝状真菌中，例如裂褶菌(Schizophyllum commune)。它们通常具有8个半胱氨酸单元。可以将疏水蛋白从天然来源中分离出来，但也可以使用基因工程方法获得(参见，例如，WO 2006/082251和WO2006/131564)。 疏水蛋白以不溶于水的形式散布在多种真菌结构的表面上，如，气生菌丝、孢子、子实体。可以从子囊菌、半知菌和担子菌中分离出疏水蛋白基因。一些真菌具有不止一个疏水蛋白基因，如裂裙菌、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)。不同的疏水蛋白显然涉及不同的真菌发育阶段。这里的疏水蛋白可能负责不同的功能(van Wetter et al., 2000, Mol.Microbiol., 36, 201-210 (van Wetter 等人，2000 年，《分子微生物学》，第 36 卷，第 201-210 页)；Kershaw et al.1998, Fungal Genet.Biol, 1998，23，18_33(Kershaw等人，1998年，《真菌遗传生物学》，1998年，第23卷，第18-33页))。迄今为止确定的疏水蛋白通常被归类为I类或II类。两种类型均在真菌中被确定为在进入两亲膜的界面处自组装的分泌蛋白。I类疏水蛋白的集合物通常是相对不溶解的，而II类疏水蛋白的集合物易溶解于多种溶剂。就疏水蛋白的生物学功能而言，除了降低气生菌丝生成时水的表面张力，还描述了孢子的疏水性(Wosten et al.1999, Curr.Biol., 19, 1985-88 (Wosten 等人，1999 年，《当代生物学》，第 19 卷，第 1985-1988 页)；Bell et al.1992，Genes Dev.，6，2382-2394(Bell等人，1992年，《基因发展》，第6卷，第2382-2394页))。此外，疏水蛋白还用于划出地衣子实体中的气体通道并充当植物表面真菌病原体识别系统中的组分(Lugοnes etal.1999, Mycol.Res., 103, 635-640 (Lugones 等人，1999 年，《真菌学研究》，第 103 卷，第635-640 页)；Hamer&Talbot 1998, Curr.0pinion Microbiol., volume I,693-697 (Hamer和Talbot, 1998年，《微生物学新见》，第I卷，第693-697页))。此前，用通常的耗时的蛋白-化学纯化(如，柱纯化和HPLC)和分离方法(如结晶)制备的疏水蛋白只有中等产率和纯度。借助遗传学方法提供较大量疏水蛋白的尝试也没有成功。 本领域需要更快速和更经济地纯化大量疏水蛋白的更有效的方法。在本申请中引用或者确认任何文件并不是承认这种文件可作为本专利技术的现有技术利用。
技术实现思路
本专利技术涉及纯化生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II的用途和方法，该方法可以包括将沉淀剂、优选地有机改性剂、更优选地醇、最优选地C1-C3醇加入生物表面活性剂溶液中以生成第一沉淀，从沉淀剂/生物表面活性剂溶液中滗析上清液并将相同或不同的沉淀剂加入上清液中以生成第二沉淀，其中第二沉淀可以是纯化的生物表面活性剂，有利地为纯化的疏水蛋白，更有利地为纯化的疏水蛋白II。生成第一沉淀的沉淀剂可以与生成第二沉淀 的沉淀剂相同或不同。优选地，本专利技术涉及纯化疏水蛋白II的用途和方法，该方法可以包括将C1-C3醇加入疏水蛋白溶液中以生成第一沉淀，从C1-C3醇/疏水蛋白溶液中滗析上清液并将C1-C3醇加入上清液中以生成第二沉淀，其中第二沉淀可以是纯化的疏水蛋白II。生成第一沉淀的醇可以与生成第二沉淀的醇相同或不同。本专利技术部分地基于 申请人:的意外发现，即可以用来自粗制浓缩物的异丙醇沉淀来纯化纯的II类疏水蛋白。在第一实施例中，醇可以是异丙醇。在有利的实施例中，可以添加约2至3体积、优选地2至3体积、更优选地2.5体积的异丙醇，以生成第一沉淀。在另一个有利的实施例中，可以将约I体积、优选地I体积的异丙醇加入上清液中，以生成第二沉淀。在第二实施例中，醇可以是甲醇。在有利的实施例中，可以添加约I至2体积、优选地I至2体积、更优选地1.5体积的甲醇，以生成第一沉淀。在另一个有利的实施例中，可以将约I体积、优选地I体积的甲醇加入上清液中，以生成第二沉淀。在第三实施例中，醇可以是乙醇。在有利的实施例中，可以添加约I至2体积、优选地I至2体积、更优选地1.5体积的乙醇，以生成第一沉淀。在另一有利的实施例中，可以将约I体积、优选地I体积的乙醇加入上清液中，以生成第二沉淀。在上述实施例中，第一沉淀可以是棕色沉淀和/或第二沉淀可以是白色沉淀。在特别有利的实施例中，可以在室温下实施该用途或方法。此外，沉淀剂、优选地有机改性剂、更优选地醇、最优选地C1-C3醇可被回收或重新用于纯化生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II。可以对用上述用途或方法纯化的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II进行冻干。具体地讲，可以用SDS-PAGE、HPLC、质谱法或氨基酸分析测定纯化的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II的纯度。因此，本专利技术的目的不是将任何此前已知的产品、产品制备工艺或产品使用方法涵盖在本专利技术内，使得 申请人:保留权利，并据此公开任何此前已知的产品、工艺或方法的免责声明。还要注意的是，本专利技术并不旨在将任何不符合USP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·舍尔，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：
国别省市：