一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用，该方法是在碳电极表面包覆分子印迹聚合物，将特异性蛋白吸附在分子印迹聚合物表面后，采用氨基苯硼酸/胆红素氧化酶/碳纳米管纳米复合物标记特异性蛋白，即得表面蛋白压印生物阴极；将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物修饰在碳电极表面，即得生物阳极；将所述表面蛋白压印生物阴极和所述生物阳极与包括PMDS电解池和外部电阻在内的部件组装，得到生物燃料电池传感器；该传感器实现了在存在多种蛋白干扰的复合体系下对特异性糖蛋白的高选择性和灵敏度，且在分子识别时不需外部供能，满足大规模生产与应用要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种构建自供能生物燃料电池传感器的方法，具体涉及一种构建表面蛋白压印的自供能的生物燃料电池传感器的方法，以及表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器用应用于特异性检测追踪复杂体系中的糖蛋白；属于生物传感器

技术介绍
糖蛋白在调节细菌致病机制，炎症反应和癌细胞转移等生物过程中扮演着重要的角色。对于临床诊断从而传输细胞的生理状态的信息来说，他们是具有重要意义的肿瘤生物标记物。目前，各种方法包括质谱分析，免疫分析，电泳以及亲和色谱法被开发用于检测和定量糖蛋白。但是绝大多数上述方法需要昂贵的试剂，复杂的操作以及外接能源，使得它们并不是很适合用于实际样品的测试。最近，自供电的生物燃料电池传感器由于结合了生物催化剂的生物催化活性而大幅提高了电化学能量的转换，从而受到广泛的关注。同时，由于其检测时不需要额外的能源，简单的制备过程，极小的尺寸以及低廉的价格，使得小型化的生物燃料电池传感器在定点检测以及将来的长远应用中具有巨大的优势。另外自供电的生物燃料电池传感器作为一种高灵敏度的以及高选择性的检测手段已经被用于检测半胱氨酸，氰化物，乙醛以及爆炸物等等，此外抗体-抗原，DNA以及适配体-蛋白也被用于与这类传感器结合来提高它的性能，这些先前的研究预示着自供电的生物燃料电池传感器在分析领域具有巨大的应用前景。但是其附加的昂贵费用以及复杂的操作严重限制了这种新理念的自供能生物传感器的定点检测和长远应用。
技术实现思路
为解决现有检测糖蛋白的分析方法存在灵敏度低、选择性差、费用昂贵、操作复杂、稳定性差等问题，本专利技术的目的是在于提供一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，该方法简单、成本低，构建的生物燃料电池传感器对糖蛋白具有高选择性识别，且在实现在分子识别时不需外部供能。本专利技术的另一个目的是在于提供所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器在检测糖蛋白中的应用，表现出高选择性和灵敏度，稳定性好，且操作简单，不需要外部供能，符合绿色化学的理念，有利于推广应用。为了实现上述技术目的，本专利技术提供了一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，该方法包括以下步骤：1)在碳电极表面包覆分子印迹聚合物(MIP)，得到分子印迹聚合物修饰的电极；将特异性蛋白吸附在所述分子印迹聚合物修饰的电极表面后，采用氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物标记所述特异性蛋白，即得表面蛋白压印生物阴极；2)将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物修饰在碳电极表面，即得生物阳极；3)将所述表面蛋白压印生物阴极和所述生物阳极与包括PMDS电解池和外部电阻在内的部件组装，得到生物燃料电池传感器。优选的方案，将乙烯基苯硼酸溶解在含聚乙二醇和Na2HPO4的溶液中，超声处理后，依次加入模板特异性蛋白溶液、安息香二甲醚、聚乙二醇及聚乙二醇二丙烯酸酯，搅拌反应，得到分子印迹预聚物溶液；将所述分子印迹预聚物溶液滴加在γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的碳电极表面，干燥，脱除模板特异性蛋白，即得分子印迹聚合物修饰的电极。较优选的方案，所述含聚乙二醇和Na2HPO4的溶液的pH为7～10；最佳为pH为9.3。较优选的方案，所述超声处理采用的超声频率为20～40kHz，超声功率为150～300W。较优选的方案，所述超声处理的时间为不小于5min，最佳为5min。较优选的方案，搅拌反应的时间为不小于10min，最佳为10min。较优选的方案，所述特异性蛋白或模板特异性蛋白为糖蛋白；如甲胎蛋白(HRP)、甲胎蛋白(AFP)、辣根过氧化酶(HRP)等。较优选的方案，干燥过程采用紫外线进行干燥至少20s；更优选为20s。较优选的方案，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的碳电极通过如下方法制备得到：将碳电极采用NaOH和二次蒸馏水反复交替洗涤后，置于含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中浸泡，洗涤，干燥，即得。进一步优选的方案，所述含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液温度为40℃～80℃，最佳为60℃。进一步优选的方案，所述含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与甲醇的体积比为1:1～1:10。进一步优选的方案，所述浸泡的时间不小于8h。优选的方案，氨基苯硼酸/胆红素氧化酶/碳纳米管纳米复合物通过如下方法制备得到：在碳纳米管溶液中依次加入羟基琥珀酼亚胺、碳化二亚胺盐酸盐、氨基苯硼酸及胆红素氧化酶溶液，在室温条件下搅拌反应后，离心分离，即得。优选的方案，将石墨烯分散液与硫堇溶液混合，剧烈震荡或搅拌后，离心收集沉淀；将所述沉淀分散在水中后，与含葡萄糖脱氢酶(GDH)的PBS溶液混合，搅拌，得到硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物溶液；将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物溶液滴加到碳电极表面，即得生物阳极。优选的方案，采用的外部电阻约为50Ω。优选的方案，将特异性蛋白吸附在所述分子印迹聚合物修饰的电极的表面后，与氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物共培养，即得表面蛋白压印生物阴极。制备的表面蛋白压印生物阴极不仅可以作为自供能生物燃料电池的阴极，且由于其良好的生物催化活性，对糖蛋白具有高选择性识别，可以构建检测特异性糖蛋白的生物传感器，以解决一般检测糖蛋白的方法存在灵敏度低、选择性差等问题。本专利技术的分子印迹预聚物溶液的制备方法：将乙烯基苯硼酸(VPBA)溶解在聚乙二醇(优选为PEG200)以及弱碱性的,Na2HPO4(0.2M)混合溶液(pH为7～10)中，在频率为20～40kHz、功率为150～300W的超声条件下，处理至少5min(优选5min)，再将模板特异性蛋白(优选糖蛋白，如辣根过氧化酶HRP)水溶液、安息香二甲醚、PEG200以及聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)依次加入到上述混合溶液中，并常温搅拌至少10min(优选10min)，得到分子印迹预聚物溶液。本专利技术的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)修饰的碳电极通过如下方法制备得到：将碳电极采用NaOH(优选0.1M)和二次蒸馏水反复交替洗涤至少三次后，置于含γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液(γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与甲醇体积比为1:1～10；优选为1:9)中，在40～80℃温度(优选60℃)下，浸泡至少8h(优选8h)，采用甲醇和二次蒸馏水洗涤，干燥，即得。本专利技术的氨基苯硼酸(APBA)/胆红素氧化酶(BOD)/碳纳米管(CNT)纳米复合物的制备过程：在500μL1mg/mL的碳纳米管溶液中依次加入50μL0.5M的羟基琥珀酼亚胺(NHS)，50μL1M的碳化二亚胺盐酸盐(EDC)，50μL浓度为2μM～20μM(优选为6μM)的氨基苯硼酸(APBA)以及10μL浓度为1mg/mL～18mg/mL(优选为12mg/mL)的胆红素氧化酶(BOD)溶液，随后混合溶液在室温下搅拌过夜(至少为12h，优选为12h)；然后反应混合溶液在0～10℃(优选为4℃)条件下10000rmp离心至少15min(优选为15min)，去除上清液，洗涤几次除去游离的BOD和APBA；得沉淀分散在pH为7.0的PB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)在碳电极表面包覆分子印迹聚合物，得到分子印迹聚合物修饰的电极；将特异性蛋白吸附在所述分子印迹聚合物修饰的电极表面后，采用氨基苯硼酸/胆红素氧化酶/碳纳米管纳米复合物标记所述特异性蛋白，即得表面蛋白压印生物阴极；2)将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物修饰在碳电极表面，即得生物阳极；3)将所述表面蛋白压印生物阴极和所述生物阳极与包括PMDS电解池和外部电阻在内的部件组装，得到生物燃料电池传感器。

【技术特征摘要】
1.一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)在碳电极表面包覆分子印迹聚合物，得到分子印迹聚合物修饰的电极；将特异性蛋白吸附在所述分子印迹聚合物修饰的电极表面后，采用氨基苯硼酸/胆红素氧化酶/碳纳米管纳米复合物标记所述特异性蛋白，即得表面蛋白压印生物阴极；2)将硫堇/石墨烯/葡萄糖脱氢酶复合物修饰在碳电极表面，即得生物阳极；3)将所述表面蛋白压印生物阴极和所述生物阳极与包括PMDS电解池和外部电阻在内的部件组装，得到生物燃料电池传感器。2.根据权利要求1所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：将乙烯基苯硼酸溶解在含聚乙二醇和Na2HPO4的溶液中，超声处理后，依次加入模板特异性蛋白溶液、安息香二甲醚、聚乙二醇及聚乙二醇二丙烯酸酯，搅拌反应，得到分子印迹预聚物溶液；将所述分子印迹预聚物溶液滴加在γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的碳电极表面，干燥，脱除模板特异性蛋白，即得分子印迹聚合物修饰的电极。3.根据权利要求2所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：所述含聚乙二醇和Na2HPO4的溶液的pH为7～10；所述超声处理采用的超声频率为20～40kHz，超声功率为150～300W；所述超声处理的时间为不小于5min。4.根据权利要求1～3任一项所述的表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法，其特征在于：所述特异性蛋白或模板特异性蛋白为糖蛋白。5.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓留，欧阳江，韩雅静，刘又年，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43