本发明专利技术涉及肺表面活性提取物与肺表面活性物质相关蛋白A（surfactantassociatedproteinA,SP-A）的组合物、药物制剂及其制备方法。采用陶瓷滤管浓缩过滤、有机溶剂提取、纯化等方法制得肺表面活性提取物；同时利用肺表面活性提取物生产过程中的废弃物制得高纯度SP-A；并将肺表面活性提取物与SP-A组合制得肺磷脂SP-A组合物。该组合物具有拮抗活性抑制的作用，在治疗肺表面活性物质缺乏或功能障碍类疾病，如肺炎、胎粪吸入综合征、支气管肺发育不良、婴幼儿体外循环术、肺损伤等所致的急性呼吸窘迫综合征以及慢性阻塞性肺疾病方面的疗效优于不含SP-A的PS制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肺表面活性提取物及肺表面活性物质相关蛋白A (surfactant associated protein A, SP-A)的组合物，内容包括三部分⑴肺表面活性提取物和SP-A的组合物，肺磷脂SP-A组合物；(2)组合物的制备方法；⑶组合物在治疗肺表面活性物质缺乏或功能障碍类疾病，如肺炎、胎粪吸入综合征、支气管肺发育不良、婴幼儿体外循环术、肺损伤等所致的急性呼吸窘迫综合征以及慢性阻塞性肺疾病方面的制药用途。本专利技术适合工业化生产。
技术介绍
肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)是肺泡II型细胞分泌的磷脂蛋白复合物，有降低肺泡气液界面表面张力，防止肺不张和肺水肿，保持肺泡稳定，参与肺的防御功能等重要作用，组成包括90%左右的脂类和10%左右的蛋白，蛋白中与PS生理功能有关的主要有四种，亲水性的SP-A、SP-D和疏水性的SP-B、SP-C，除SP-D外，其他三种蛋白在 PS 的功能活性中均有重要意义(Kaushik Nag edited Lung Surfactants: function and disorder, Published by Taylor & Francis Group,2005)。现有技术制备的肺表面活性提取物是指牛、猪或其他哺乳动物的肺灌洗液或全肺勻浆提取液，经分离、提取、纯化得到的磷脂蛋白复合物，也称PS制剂，因工艺所限，组成以磷脂为主，仅含有少量疏水性蛋白SP- B和SP-C，是治疗早产儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)的重要急救药，已在全球大多数国家和地区应用， 自上市以来早产儿死亡率下降一半以上。但是目前临床应用的PS制剂均不含具有免疫调控作用的 SP-A (Bernhard, Mottaghian, Gebert, et al. , Commercial versus native surfactants Surface Activity, Molecular Components, and the Effects of Calcium, Am J Respir Crit Care Med, 2000, Vol 162 :1524)，在 PS 功能障碍类疾病，如肺炎、胎粪吸入综合征、婴幼儿体外循环术、支气管肺发育不良、肺损伤等导致的急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome，ARDS)以及慢性阻塞性肺疾病等的疗效有限，因受到炎症蛋白或因子的抑制，作用持续时间短，仅能在短期内改善肺功能。SP-A在肺表面活性物质蛋白中含量最高，属糖结合蛋白家族，由248个氨基酸组成，等电点4. 6-5. 5，分子量约为26-38kDa，具有多种生理功能，如参与肺泡表面PS膜的形成和代谢，稳定细胞内外肺表面活性物质，参与局部防御，增强PS对各种抑制因子的抵抗， 调节局部免疫和炎症反应等，是近年来的研究热点。分析现有技术，肺表面活性提取物和SP-A的制备技术存在如下问题(1)对于肺表面活性提取物的制备，无论其来源是全肺勻浆提取液，还是肺灌洗液，均需要处理大量的、含有多组分磷脂和表面活性物质蛋白的混悬液或乳浊液。传统方法主要是采用多级离心或差速离心，然后再使用有机溶剂提取、层析纯化或超临界提纯等。其中多级离心和差速离心耗时长，能耗大，生产成本高，磷脂组分收率低。(2)对于SP-A的分离和制备，有从动物肺灌洗液中提取得到SP-A ；也有研究者通过基因重组技术将SP-A功能片段融合到工程菌种中，培养、纯化得到高纯度的SP-A。前者实用性不强，会影响动物肺来源的PS制剂的生产，无法实现产业化；后者仅处于实验室阶段，且不能得到完整表达的SP-A，距离产业化还有很长的路要探索。(3)对于肺表面活性提取物与SP-A的组合物，鉴于SP-A为亲水性蛋白，PS制剂中的磷脂和小分子蛋白均为疏水性，两者以怎样的方式、怎样的比例组合，才能得到活性高且稳定的制剂，是目前尚未解决的问题。为此，本专利技术将肺表面活性提取物与SP-A组合，得到活性更高、治疗范围更广的新组合物。同时选择与现有技术不同的路线和工艺，开发了与传统方法不同、能更有效地制备牛肺表面活性提取物的方法，并利用肺表面活性提取物生产过程中的废弃液，提取得到具有生物活性的高纯度SP-A。本方法不影响肺表面活性提取物的生产，解决了产业化问题。
技术实现思路
本专利技术提供了肺表面活性提取物与SP-A的新组合物，及该组合物的制备方法；同时提供了制备肺表面活性提取物的新方法，以及利用肺表面活性提取物制备过程中的废弃物制备SP-A的工艺。本专利技术所述的新组合物可用于治疗PS缺乏或PS功能障碍类疾病，改善肺表面活性提取物拮抗抑制的活性及疗效。1、肺表面活性提取物的制备工艺流程为肺灌洗液或全肺勻浆提取液，经低速离心去除血细胞和组织碎片，取上清液经陶瓷滤管浓缩得到浓缩液，高速离心取沉淀，经有机溶剂提取、纯化得到肺表面活性提取物。具体步骤如下⑴肺灌洗液或全肺勻浆提取液静置或(500-1000) Xg离心，取上清液。⑵上清液使用装有微孔陶瓷滤管的浓缩过滤系统浓缩，透过滤管的滤过液弃去， 收集得到浓缩液，其中装有陶瓷微孔滤管的浓缩过滤系统(孔径lO-lOOOnm，优选10-350nm ；工作压力 <0. 5MPa，优选0. 1-0. 35Mpa)预先使用平衡液平衡，优选平衡30-60分钟(更优选35-40分钟)，然后加入⑴中的上清液，在0-40°C条件(优选4-35°C )下进行浓缩过滤，最后使用洗脱液洗出残留在系统中的活性成分，并将所得洗脱液循环通过浓缩过滤系统，优选循环20-40 分钟(更优选30分钟)，使系统中的物料充分洗脱下来。上述平衡液和洗脱液使用无机盐溶液，如氯化钠溶液(优选0. 1-0. 5 mol/L，更优选0. 1-0. 2 mol/L，最优选0. 15 mol/L)，氯化钙溶液(优选1. 5-50 mmol/L)，或二者的混合液。(3)将⑵所得浓缩液高速离心(彡10000 X g)，取离心后的沉淀备用。⑷将⑶所得沉淀用有机溶剂进行萃取，有机溶剂优选溶剂A和溶剂B的混合液， 其中溶剂A和溶剂B的体积比优选1 :1至1 :3，最优选1 :2 ；溶剂A选自正己烷、石油醚、甲醇、乙醇等，溶剂B选自二氯乙烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯等。分离出下层含有表面活性磷脂的萃取液备用，剩余废弃液用于制备SP-A。(5)将⑷所得萃取液过滤，真空干燥，制得肺表面活性提取物。6(6)也可将⑶所得沉淀使用CO2超临界提取技术直接提纯。将1份沉淀与1-3份 (优选1-2份)硅藻土 (或玻璃珠等惰性载体)混勻，干燥，放入提取槽，用(X)2流体萃取获得分离液，萃取压力20-30Mpa (优选25_30Mpa)，温度优选20-50°C (更优选30-50°C，最优选 40°C)。为提高萃取效率，可加入少量极性溶剂(如乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯等)作为夹带剂或共溶剂，优选加入乙醇或氯仿。提取结束后用氯仿清洗分离槽，将所得氯仿溶液与分离液合并，过滤，干燥，得到肺表面活性提取物。(7)上述( 或(6)所得肺表面活性提取物，可任选下列方法中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于顺廷，寇同欣，陆文超，赵海英，秦晓君，胡金艳，王梦德，
申请(专利权)人：北京双鹤现代医药技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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