人促血小板生成素变异体、其ｃＤＮＡ制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了人促血小板生成素（ＴＰＯ）变异体，其互补ＤＮＡ克隆和表达，以及其活性检测方法及应用。本发明专利技术的人促血小板生成素变异体与天然ＴＰＯ具有至少５０％的同源性，其保留原始氨基酸序列第１７０位的胱氨酸，但第１１３位氨基酸由ｇｌｕ变异为ｇｌｎ。本发明专利技术ＴＰＯ变异体的发现、成功地克隆和真核细胞表达为血小板增殖／分化异常性疾病及其他相关疾病的诊断和治疗提供了新的工具。本发明专利技术使用ＴＦ－１细胞株和小鼠骨髓干细胞作为体外活性检测的反应细胞，进一步提高了ＴＰＯ活性检测的再现性和灵敏性，而且操作更为简便。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新的人促血小板生成素变异体，其cDNA克隆和表达，以及其活性检测方法和应用。一般认为，血小板产生是受谱系特异性体液因子调节的，且其中主要因子是称为促血小板生成素(TPO)的细胞激活素(Mcdonald，T.P，P.Expl，Hematol，16201～～205(1988))。也已报导了称为巨核细胞集落刺激因子(meg-CSF)或促血小板生成素(TPO)的活性，前者影响巨核细胞的分化，后者影响巨核细胞的成熟与血小板的产生(Williams，N.et al，Blood cell，15123-133(1989))。另外，一些研究结果揭示，原致癌基因C-Mpl的配体可能是与meg-CSF或TPO活性相似的巨核细胞谱系特异性生长因子。最近，de Sauvage F.J等人从再生障碍性贫血猪的血浆中纯化了Mpl配体(ML)，并利用所得到的氨基酸序列信息分离了人ML互补DNA(cDNA)(Nature，369533-538(1994))。证明ML与促红细胞生成素(EPO)有序列同源性，并且具有meg-CSF和促血小板生成素样活性。Si Lok等人也克隆了由原致癌基因C-Mpl编码的蛋白的配体的成熟cDNA序列(Nature，369565-568(1994))。结果揭示C-Mpl的配体即是促血小板生成素。谱系特异性的C-GMpl的配体支持巨核细胞集落形成，在发育的晚期阶段增大巨核细胞体积，多倍体化及分化标志的表达。在体内，C-Mpl配体通过扩充骨髓与脾巨核细胞及其祖细胞刺激血小板产生(K.Kaushansky et.al，Nature，369568-571(1994))。另外，F.Wendling等人(Nature，369571-574(1994))的实验显示，C-Mpl编码的受体与参予血小板体内平衡节之体液因子的配体(C-Mpl配体)结合，并提示C-Mpl配体、TPO和meg-CSF是同一种分子。R.C.Skoda等人(The EMBO J.12(7)2645-2653(1993))曾报导了一种新的截短形式的Mpl蛋白质，并证明可从被转化的COS-1细胞的溶胞产物中同时免疫沉淀出全长和截短形式的Mpl蛋白质，而这种含分泌信号但无跨模序列的截短形式的Mpl，则不存在于培养液中。最近，在我们的专利技术完成之后，Gurney，A.L.等人(Blood，85981～988，1995)进一步报导了称为TPO2的新的TPO变异体。已经证明，在TPO的生物合成系统中因存在RNA替换剪切(RNAAlternative Splicing)过程，导致全长TPO序列中四个连续的氨基酸序列132LPPQ135丢失，从而得到该变异体。一般认为，TPO变异体(TPOV)蛋白质参予胚胎早期巨核细胞干细胞的分化和增殖，且随着胚胎发育过程的进展，TPO和TPOV之间形成一个特有的生理平衡，从而调整节TPO表达水平。任何内在和外在干扰因素的影响，打破这种正常平衡状态，均可导致血小板细胞分化和发育的异常或障碍。因此，这些新的血细胞生长因子的发现及对其功能的阐述，将有利于进一步了解血小板功能异常相关疾病的发病机理，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供依据。就下述本专利技术TPOV的一级结构而言，特别值得注意的是，其C末端氨基酸顺序和其完整顺序中段出现的glu→gln氨基酸突变。虽然目前对TPO和TPOV的C末端氨基酸顺序的功能尚未完全阐明(Nature 369365～568，1994)，但据信该多肽片段可以用作例如使用核糖核酸酶保护检测法(RNase Protection Assay)和利用特异性单克隆抗体的免疫检测法诊断某些血小板生成异常性疾病或其他恶性血液病的标记物。另外，尽管TPOV序列中glu-gln氨基酸突变的意义尚有待进一步研究，但这一突变对于鉴别TPO和TPOV无疑是十分重要的。再者，业已发现，主要以膜结合蛋白质形式存在的TPOV，在微量条件下即表现出对骨髓干细胞的刺激作用，此揭示TPOV也同样会影响某些髓样白血病细胞或髓样间变细胞。因此，对TPOV的进一步深入研究，将有助于了解这些恶性病变的机理，为寻找进行基因治疗和蛋白质工程治疗的途径提供基础。因此，本专利技术的目的是基于某些细胞因子广泛存在的RNA替换剪选(RNA Alternative Splicing)机制，而产生多种与细胞分化过程有关的细胞因子变异体这一事实，利用DNA重组技术分子克隆可能存在的新的TPO变异体。本专利技术的再一个目的是建立检测本专利技术的TPOV活性的新的检测方法，即本说明书下文所述的TF-1细胞增殖活性检测法和CFU-MK(CFU-meg)为基础的活性检测法。本专利技术进一步的目的是制备特异性结合TPO变异体中变异氨基酸或氨基酸片断的抗体，用以鉴别TPO和TPO变异体；建立一种简易准确的核苷酸分析方法，以区分TPO和TPO变异体，从而用于血小板及其他血液病的诊断。因此，本专利技术提供了如图2所示的一种新的促血小板生成素变异体多肽序列及其cDNA编码序列。本专利技术进一步提供了以DNA重组技术制备上述促血小板生成素变异体的方法，该方法包括以下步骤1)提供人胚肝细胞cDNA库作为模板，2)以下列合成的寡核苷酸对为引物，经逆转录酶—聚合酶链反应(RT-PCR)扩增所需的DNA序列，①5′CTAG ATCAAG CTTAAC AGG GAG CCA②5′GAT CCTAGA ATT CTTACC CTT CCT GAG ACA 3′3)将所得到的扩增产物与适当的质粒载体连接，4)用所得到的重组质粒转化适当的宿主细胞，5)在适于表达TPOV多肽的条件下培养被转化的宿主细胞并回收所需的TPOV多肽产物。本专利技术进一步提供了以TF-1细胞增殖检测法检测样品中TPO活性的方法，特征在于其改进包括使用TF-1细胞作检测程序中的效应细胞。另外，本专利技术还提供了以骨髓干细胞反应检测法体外检测TPO活性的方法，该方法包括以下步骤1)提供适当数目作为效应细胞的小鼠骨髓干细胞；2)在有丝分裂素激活的脾细胞悬液存在下，向培养的小鼠骨髓干细胞中加入待检TPO或TPOV样品；3)待半固体凝胶形成后进行乙酰胆碱脂酶(AchE)染色；4)基于AchE阳性巨核细胞数判断被检测样品中的TPO或TPOV活性。本专利技术进一步提供了本专利技术的TPOV蛋白质在血小板生成异常相关疾病的诊断中的应用，其中所用的诊断方法包括核糖核酸酶保护检测法和使用特异性单克隆抗体的免疫检测法。最后，本专利技术提供了以本专利技术的TPOV蛋白质为活性成分，并含有医药上可接受的载体及赋形剂的药物组合物，以及该组合物在治疗血小板细胞分化与发育异常相关疾病中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，我们以已建立的人胚肝细胞cDNA库为模板，利用反转录酶—聚合酶链反应(ET-PCR)技术，以下列合成的寡核苷酸对作为引物，经30次循环(95℃1分钟、52℃1分钟、72℃2分钟)扩增所说的引物对①5′CTAG ATCAAGCTTAAC AGG GAGCCA②5′GAT CCT AGA ATT CTT ACC CTT CCT GAG ACA 3′所得PCR反应混合物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，发现除TPO主带外，还可见一个分子量较小的可能的TPO变异体带，但也不能排除该本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码具有血小板增殖和／或分化促进活性的多肽的核苷酸序列，特征在于其具有核苷酸序列或及其部分，或其功能等同物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王楠，张旋，
申请(专利权)人：山东格兰百克生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]