具有血小板生成素活性的蛋白质制造技术

本发明专利技术涉及具有特异性刺激或增加血小板生成之生物活性并含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６氨基酸序列的１－３３２的血小板生成素（ＴＰＯ）多肽或其衍生物，涉及编码ＴＰＯ多肽的ＤＮＡ分子、生成所说多肽的方法、与所说多肽有特异性免疫反应的抗体以及用所说多肽治疗血小板紊乱如血小板减少症的方法。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是现今未决的1995年1月31日提交的美国专利申请(申请号未知)的部分连续申请，后一申请是现今未决的1994年12月22日提交的美国专利申请No.08/361,811的部分连续申请，后一申请是现今未决的1994年10月11日提交的美国专利申请No.08/320,300的部分连续申请，后一申请是现今未决的1994年7月20日提交的美国专利申请No.08/278,083的部分连续申请，后一申请是现已放弃的1994年4月1日提交的美国专利申请No.08/221,020的部分连续申请，后一申请是现已放弃的1994年3月14日提交的美国专利申请No.08/212，164的部分连续申请。专利
本专利技术涉及具有以特定方式在体内刺激或增加血小板生成或增强巨核细胞祖细胞增生和分化之活性的新蛋白质、编码所说蛋白质的DNA序列及其制备方法。专利技术背景巨核细胞是胞体较大、富含胞浆的多核细胞，它能产生血小板，主要见于骨髓中。巨核细胞起源于骨髓中的多能造血干细胞。原始的多能干细胞在某种程序内分化成巨核细胞祖细胞，后者定型为巨核细胞系。巨核细胞祖细胞增生和分成成巨核细胞。巨核细胞进一步进行多倍体和细胞质成熟，最后将其无核胞质碎片(即血小板)释放到循环中。一个成熟的巨核细胞平均形成2,000-4,000个血小板。尽管血小板的形成机理在一些细节上尚不清楚，但据认为，巨核细胞典型地是位于骨髓窦腔内皮的白蛋白(albuminal)表面，它产生延及窦状隙的胞浆处理过程，籍此巨核细胞进行血小板的碎片化。有关产生血小板的机理还存在许多疑点，尽管认为有可能巨核细胞存在于骨髓静脉窦皮层，胞质穿过皮层，在静脉内壁上产生索样凸起，籍此，血小板被释放。据认为，对于巨核细胞造血血小板产生的生成及调控中存在一种特定功能。在健康人类和动物中，虽然已知给例如健康动物施用抗血小板抗体后，血小板数迅速减少，然后开始暂升至高于平常，但最后回复至正常水平，所以有效血小板的数量被维持在一定水平。同样，已知在临床中血小板数减少(血小板减少症)或血小板数增加(血小板增多症)甚至见于红细胞和血细胞数处于正常水平时。顺便提一句，血小板最重要的功能是在止血机理中形成血栓。如果止血机理由于血小板数减少而不能正常发挥作用，则将导致出血趋势。已证明了有关巨核细胞生成和血小板生成中存在特定的调节机理。血小板在健康人体内和正常的动物中维持着有效数量。然而，已知当抗血小板抗体被施用于动物时，血小板数只在短期内迅速减少，之后开始回升并暂时超过正常水平，最终回复至正常水平。在临床领域中还了解到，血小板数减少(血小板减少症)或血小板数增加(血小板增多症)甚至见于红细胞和白细胞数正常的情况下。但是，至今尚无成功分离和鉴定涉及血小板产生的特定调节因子(例如，象红细胞形成过程中的促红细胞生成素)的报道。血小板最重要的功能是在止血机理中形成血凝块。当止血机理的正常功能因血小板减少而遭破坏时，则会发生出血趋势。在癌症的放疗和化疗领域中，由骨髓抑制所致的国小板减少是致死的并发症；给这类患者输注血小板以防止出血趋势。血小板输注也应用于骨髓移植后的患者或再生障碍性贫血的患者。用于这类血小板输注的血小板可通过血小板除去法由健康血供体的血液中制备，但用于输注的这类血小板的半衰期短，并有可能产生细菌污染。血小板输注还可能因输注用的血小板中污染了淋巴细胞而存在使患者接触有害病毒(如人类免疫缺陷病毒HIV或各种肝炎病毒)、诱导对输注血小板的主要组织相容性抗原(HLA)有特异性的抗体或导致移植物抗宿主疾病(GVHD)的危险。因此，如果能在血小板减少的患者体内刺激固有的血小板形成，并同时减少血小板输注的依赖性，这将是非常有益的。另外，如果能够纠正或预防进行放疗或化疗的癌症患者的血小板减少，就可以使这类治疗更加安全，有可能增加治疗的强度并进一步改善所期望的抗癌效果。由于上述种种原因，人们对分离和鉴定涉及调节巨核细胞和血小板生成的特异性调节因子进行了大量的研究。根据体外研究结果，控制巨核细胞生成的调节因子大致分成下面两种因子(参见Williams etal.，J.Cell.Physiol.，vol.110，p101-104，1982)。巨核细胞集落刺激因子(Meg-CSF)是在半固体培养基中刺激CFU-MK增生和分化以形成巨核细胞集落的调节因子。另一种称为巨核细胞增效因子(Meg-Pot)、巨核细胞刺激因子、血小板生成刺激因子等的调节因子主要作用于未成熟或成熟的巨核细胞，籍此增强其分化与成熟。在某些情况下，Meg-Pot可与Meg-CSF一起被检测到。另外，因为当将由实验诱导的血小板减少动物收集的血清或血浆施用于另外的正常动物时血小板计数增高，所以表明存在一种能够在体内促进血小板生成的促进因子，称为血小板生成素(TPO)。近年来，检查了一些其基因已被克隆的细胞因子刺激巨核细胞生成和血小板生成的能力。人IL-3刺激人巨核细胞集落的形成(Bruno etal.，Exp.Hamatol.，vol.16，p371-377，1988)，并至少升高猴的血小板计数(Donahue et al.，Science，vol.241，p1820，1988)。然而，因为IL-3对所有造血细胞的增生和分化都起作用，所以它不同于控制巨核细胞生成和血小板生成的特异性调节因子。人IL-6没有表现出Meg-CSF活性，但它作用于未成熟的巨核细胞，并促进其分化为成熟的巨核细胞(Williams et al.，Exp.Hamatol.，vol.18，p.69，1990)。体内施用IL-6能诱导血小板生成，促进灵长目骨髓巨核细胞的成熟和向更高倍性升迁，但也产生一些副作用，如体重减轻、诱生急性期蛋白质(Asano et al.，Blood，vol.75，p1602-1605，1990；Stahl et al.，Blood，vol.78，p1467-1475，1991)。人IL-11无Meg-CSF活性，但有Meg-Pot活性，并促进小鼠的血小板生成(Neben et al.，Blood，vol.81，p901-908，1993)。另外，人LIF显著地提高灵长目的血小板数(Mayer et al.，Blood，vol.81，p3226-3233，1993)，但其在体外对巨核细胞的作用很微弱(Burstein et al.，J.Cell.Physiol.，vol.153，p305-312，1992)。尽管希望将这些细胞因子作为血小板增效因子应用于临床，但其功能对巨核细胞系并非特异，并且它们能引起副作用。因此，在临床上需要开发一种既对巨核细胞-血小板系统具有特异性又能引起较少副作用的血小板增加因子。已发现在血小板减少的患者或动物的血清、血浆或尿液中或在某些被培养的人细胞系的培养物上清液中存在Meg-CSF、Meg-Pot或TPO活性。然而，目前仍不清楚这些活性是否因为存在单种因子或几种因子的共同存在造成，也不清楚这些因子与已知的细胞因子是否不同。Hoffman等人发现，再生障碍性贫血和无巨核细胞性血小板减少性紫癜患者的血清含有Meg-CSF活性，它显著地增加巨核细胞集落的形成(Hoffman et al.，N.Eng.J.Med.，vol.305，p533-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ，它包含一种编码蛋白质的氨基酸序列的碱基序列，所述蛋白质具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１意旨氨基酸序列１－３３２）所示的氨基酸序列，或在部分氨基酸序列中含有取代、缺失、插入和／或添加的氨基酸序列，所述蛋白质具有ＴＰＯ活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：宫崎洋，加藤尚志，大上钦也，岩松明彦，赤崛弘典，黑木良太，清水敏之，武藤隆则，
申请(专利权)人：麒麟麦酒株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]