人细胞株产生的人血小板生成素、其制备方法及包含该物质的药物组合物技术

本发明专利技术涉及由人血小板生成素（ＴＰＯ）产生脏器来源的细胞株（例如，人肝脏来源的细胞和人骨髓基质瘤细胞）产生的与天然型糖链结构类似的ＴＰＯ；ＴＰＯ的制备方法，包括在人细胞株中表达外源性人ＴＰＯ基因；和包含ＴＰＯ的药物组合物，如用作血小板减少症的治疗剂；至少具有α２，６连接型唾液酸化糖链结构的人ＴＰＯ。本发明专利技术的ＴＰＯ可望降低抗原性和改善体内的动力学。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本专利技术涉及人细胞株产生的新型人血小板生成素糖蛋白，特别是涉及能降低抗原性和改善体内动力学的新型人血小板生成素蛋白、其制备方法及包含该物质的药物组合物。人血小板生成素(thrombopoietin，简称TPO)是作为Mpl的配体而克隆出的糖蛋白，而Mpl是细胞因子受体家庭成员之一(de Sauvage等，Nature(London)，369卷，533-565页，(1994)；Bartley，T.D.等，Cell，77卷，1117-1124页，(1994))。这些Mpl配体均可在血小板减少症动物(例如，人、小鼠、狗等)的血清和血浆中检测出来，因此确定它们与巨核细胞和血小板的形成相关。以开发血小板减少症的治疗剂为目标，本专利技术人以促进由大鼠骨髓高度纯化的巨核前体细胞生成巨核细胞的活性为指标，从血小板减少症的大鼠血浆中纯化了大鼠的TPO，在其部分氨基酸序列的基础上，克隆了大鼠的TPO cDNA，进一步克隆了人的TPO cDNA，通过基因重组技术成功地获得了大量均一的人TPO(H.Miyazaki等，实验血液学，22卷，838页，(1994))。经证明，本专利技术人成功取得的人TPO与前面作为人Mpl配体而取得的因子具有相同的氨基酸序列(参照后面的序列表序列号1)。本专利技术人将该人TPO给予因方便用抑癌剂和免疫抑制剂或由(放射线照射)及BMT而引起骨髓抑制的血小板减少症的小鼠时发现，它能阻止血小板减少、促进血小板增加，而且看到造血功能的亢进，该人TPO对这些血小板减少症有效。目前关于人TPO，已有人血浆中TPO的报道(Matsumoto，A，等，第38届ASH年会(1996))，但由于未得到分离、纯化的物质，所以其结构功能未知。另外，由各种细胞所产生的TPO可在mRNA及ELISA水平检测出来。用来源于人的肝细胞(HepG2)(Hino，M.等，生物化学和生物物理研究通讯，217卷，475-481页，(1995))，可检测出组成型mRNA。另外，用人胎儿肾脏细胞(HEK)可检测出TPO mRNA，它具有使mpl表达细胞(mo7e，BaF3/mpl)增殖的活性。但是仍未能对其进行分离、纯化，包括体内活性在内，其结构、功能尚不知道。另一方面，应用基因重组技术生产的重组人TPO，可在非洲绿猴肾脏细胞(COS-1)中表达(Kato，T.等，生化学杂志，118卷，229-236页，(1995))，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达(Morita，H.等，FEBS Lett 395卷，228-334页，(1995)，Kato.T.等，美国国家科学院院刊，94卷，4669-4697页，(1997))，在大肠杆菌(Ann.M.F.等，血液，86卷，54-59页，(1995))，小仓鼠肾脏细胞(BHK)(Ross，C.H.等，生物化学，35卷，14849-14861页(1996))、人胎儿肾脏细胞(HEK 293)(de Sauvage等，自然，369卷，533-538页(1994)；Bartley，T.D.等，细胞，1117-1124页，(1994))中表达。但是，到目前为止还没有关于用来源于TPO产生器官的人细胞株来表达TPO的报道。另外，由上述各种非人细胞株所产生的TPO，与人细胞株产生的人TPO以及人血中的TPO在结构上有何异同尚未明了。因此，目前其结构的差异与TPO功能间的关系如何尚未见报道。一般而言，具有TPO样生理活性的糖蛋白，除主要的TPO产生脏器以外，还有其它产生该蛋白质的脏器，由于来源于这种、那种脏器或脏器细胞的种类不同，有时所产生的该糖蛋白质的结构不同。同样，用基因重组技术生产的重组糖蛋白质，由于所用宿主细胞不同，其所产生的糖链结构不同。尤其是用动物细胞作宿主细胞时，由于其种类的不同(动物种类或来源器官的种类、细胞株等)所添加的糖链结构多种多样，这种差异给蛋白质的功能，主要是抗原性、体内动力学等带来不少影响。事实上，目前有对很多基因重组蛋白药品产生抗体的报道(Steis等，N.Eng.J.Med.318卷，1409-1413页(1988)等)，这只是因为它们与体内的天然蛋白在构造、功能上存在差异造成的。若有在抗原性、体内动态方面具有更优良性质的人TPO糖蛋白，预计其作为药品的价值更高一畴。专利技术概要本专利技术提供人细胞株产生的人血小板生成素(TPO)。本专利技术的实施方案中，TPO是由内源性或外源性的人TPO基因在人细胞株中的表达产物，产物被分离、纯化。另外，作为人细胞株推荐TPO产生脏器来源的细胞株，例如JHH7(FERM BP-6049)、HuH7(FERM BP-6048)等来源于人肝脏的细胞，和人骨髓基质瘤细胞。本专利技术的TPO含有与SSA凝集素柱具有亲合性的糖链结构，或者，至少含有α2，6连接型唾液酸化糖链结构。其氨基酸序列具有如序列表的序列号1中所示1-332位的氨基酸。本专利技术还提供以上述定义的人TPO为有效成分的药物组合物。具体而言，该TPO可用作血小板增加剂，血小板障碍治疗剂、血小板减少症治疗剂。本专利技术的TPO作为药剂使用的时候，可具有降低抗原性和改善体内药代动力学等优点。本专利技术还提供人TPO的制备方法，它包括在来源于TPO产生脏器的人细胞株内表达外源性的人TPO基因。作为人细胞株可应用上述来源于人肝脏的细胞(例如JHH7(FERM BP-6049)等)和人骨髓基质瘤细胞。用该方法所获得的人TPO也包含于本专利技术中。本专利技术还提供至少具有α2，6连接型唾液酸化糖链结构的人TPO。这里的人TPO可以是外源性的人TPO基因在细胞株内的表达产物、产物被分离、纯化。而作为细胞株可以是导入了α2，6唾液酸基转移酶基因的CHO细胞。另外，本专利技术还提供至少具有α2，6连接型唾液酸基糖链结构的人TPO的制备方法，它包括将α2，6唾液酸基转移酶cDNA导入CHO细胞中，然后在该CHO细胞中表达人TPO基因，或者在CHO细胞中表达人TPO基因，然后将α2，6唾液酸基转移酶cDNA导入该CHO细胞的制备方法。附图简述附图说明图1是通过电泳比较重组ChoTPO、天然HepTPO(JHH7)和天然HepTPO(HuH7)分子量的照片。检测是在电泳后，进行与抗TPO羊IgGXRAG-HRP的反应。每一泳道用250pg的TPO。图2是通过电泳比较重组HepTPO(JHH7/7/c83)、天然HepTPO(JHH7)和重组ChoTPO的分子量的照片。检测与图1同样进行。图3是应用凝集素ELISA法比较图中所示的各TPO与SSA凝集素或MAM凝集素的反应性。图4是应用FDCP-hMp1635分析法显示图中所示的TPO的体外活性。图5是通过电泳/Western印迹(使用抗hTPO羊多克隆抗体和辣根过氧化酶结合的抗羊IgG兔多克隆抗体)比较克隆CHO+2，6ST/19/c4和CHO+2，6ST/21/c3产生的TPO，与克隆CHO29c14产生的重组ChoTPO分子量的照片。图6表示用凝集素-ELISA法分析克隆CHO+2，6ST/19/c4和CHO+2，6ST/21/c3产生的TPO的唾液酸的结果。图7表示应用FDCP-hMp1635测定法比较导入了α2，6唾液酸转移酶cDNA的CHO细胞(图中以19c4和21c3表示本文档来自技高网...

【技术保护点】
人细胞株产生的人血小板生成素（ＴＰＯ）。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：森田晴彦，松本笃志，加藤尚志，大桥秀哉，
申请(专利权)人：麒麟麦酒株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]