分泌产生血小板生成素多肽的方法技术

本文公开了在血小板生成素的产生中有用的ＤＮＡ构建体。总的来说，所述ＤＮＡ构建体包含第一ＤＮＡ片段（其编码连接到血小板生成素多肽上的氨基－末端分泌肽的融合体）和一个或多个附加ＤＮＡ片段（其有利于第一片段的转录）。所说的分泌肽是天然哺乳动物的ｔ－ＰＡ分泌肽或者可以是为增加融合体的蛋白体水裂解而修饰的哺乳动物ｔ－ＰＡ分泌肽。本文也公开了包含这些ＤＮＡ构建体的培养的真核细胞以及通过采用所述ＤＮＡ构建体和培养的真核细胞产生血小板生成素多肽的方法。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
造血是血细胞从骨髓中的多能干细胞发育和分化的过程。这个过程包括复合物和多肽生长因子(细胞因子)通过靶细胞上膜结合的受体相互影响作用。细胞因子的作用导致细胞增殖和分化，同时伴随着对特定的常常是血统特异性的和/或阶段特异性的细胞因子的反应。单细胞型(如血小板)从干细胞的发育可能需要在适当的序列中作用的许多细胞因子的协同作用。已知的细胞因子包括白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8等)和集落刺激因子(如G-CSF、M-CSF、GM-CSF、红细胞生成素(EPO)等)。通常，白介素作为免疫和炎症反应的介质。集落刺激因子刺激骨髓衍生的细胞的增殖，活化成熟白细胞，另外可形成宿主对炎症、感染和免疫激发反应的整合部分。已经把各种细胞因子开发为治疗剂。例如，刺激红细胞发育的红细胞生成素可用于治疗由于肾衰竭引起的贫血。用几种集落刺激因子与癌症化疗相结合以促进患者免疫系统的恢复。白介素-2、α-干扰素和γ-干扰素用于某些癌症的治疗。刺激巨核细胞生成和血小板生成的活性物已在血小板减少的动物体液中鉴别出来，在文献中称为“血小板生成素”(最近由McDonald的Exp.Hematol.16201-205，1988和McDonald的Am.J.Ped.Hematol.Oncol.148-21，1992回顾)。前不久鉴别了几组蛋白质和/或克隆了一种结合到细胞mpl受体并刺激巨核细胞生成和血小板生成的蛋白质。参见，de Sauvage等，自然369533-538，1994；Lok等，自然369565-568，1994；Kaushansky等，自然369568-571，1994；Wendling等，自然369571-574，1994和Bartley等，细胞771117-1124，1994。有人提议把这种蛋白质称为血小板生成素(Kaushansky等，同上)。氨基酸序列分析表明成熟的小鼠TPO从SEQ ID NO2的氨基酸残基45(丝氨酸)延伸到残基379(苏氨酸)。预期的人蛋白质的氨基末端精确地对应于已证明的重组鼠TPO的成熟氨基末端(Lok等，同上)，即氨基末端在SEQ IDNO4的丝氨酸(22)，蛋白质延伸到SEQ ID NO4的氨基酸残基353。TPO易受蛋白水解，并已经以多相的或降解的形式分离(Sauvage等，自然369533-538，1994；Bartley等，细胞771117-1124，1994)。已经发现如25kD的小分子种类在体外是活性的(Bartley等，同上)，已经报道了153个氨基酸(Sauvage等，同上)和174氨基酸(Bartley等，同上)的重组人TPO多肽在体外是活性的，其具有全长人cDNA的表达产物，其中cDNA编码353个氨基酸的初级翻译产物(Bartley等，同上)。血小板生成素看来似乎是蛋白水解的对象，并可以多相的或降解的形式分离(Bartley等，同上；Sauvage等，同上)。因此，尽管至少一些蛋白水解产物具有生物学活性，科技文献中所报道的血小板生成素制剂对于各种分子种类的组合物和相关的活性物不具有明显的特征。然而，很少有工作可确定血小板生成素大规模生产的日期，在本领域中仍需要一种大量地而花费较少的方式生产蛋白质的方法。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供产生血小板生成素的方法。本专利技术的另一个目的是提供指导重组血小板生成素从宿主细胞分泌的方法。本专利技术的目的还在于提供指导高水平的血小板生成素表达和分泌的DNA构建体。本专利技术一方面提供了一种DNA构建体，此构建体包含(a)编码多肽融合体的第一DNA片段，该融合体包含连接到血小板生成素(TPO)多肽上的氨基末端分泌肽，连接的肽和多肽在其接合处有一个蛋白水解的裂解位点；(b)一个或多个附加DNA片段，这些片段可操作地连接到第一DNA片段上以利于其转录，其中所说的分泌肽选自天然哺乳动物组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)分泌肽和为增加接合处蛋白水解裂解而修饰的哺乳动物t-PA分泌肽。在一个实施方案中，分泌肽是人t-PA分泌肽。在一个有关的实施方案中，分泌肽包含SEQ ID NO5所示的氨基酸残基序列，其中所说的Xaa(29)，Xaa(31)和Xaa(33)分别是任何氨基酸，Xaa(34)是丙氨酸，精氨酸或赖氨酸。在另一个实施方案中，Xaa(29)和Xaa(31)分别是除赖氨酸、精氨酸、或组氨酸外的任何氨基酸。在另一个实施方案中，Xaa(33)是甘氨酸；Xaa(34)是精氨酸或赖氨酸；Xaa(29)和Xaa(31)分别是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或丙氨酸，Xaa(33)是甘氨酸；Xaa(34)是精氨酸；或者Xaa(29)是精氨酸或谷氨酸，Xaa(31)是精氨酸或谷氨酰胺，Xaa(33)是甘氨酸，并且Xaa(34)是精氨酸，其条件是至少Xaa(29)和Xaa(31)之一不是精氨酸。在另一个实施方案中，TPO多肽包含144到335个氨基酸残基。在一个相关的实施方案中，TPO多肽包含144到191个氨基酸残基。在另一个实施方案中，TPO多肽包含选自下组序列的氨基酸序列，所述序列如SEQ ID NO4所示的从丝氨酸(22)到缬氨酸(173)，丝氨酸(22)到精氨酸(185)，丝氨酸(22)到天冬酰胺(193)或丝氨酸(22)到谷氨酰胺(235)的序列。本专利技术另一方面提供了包含第一DNA片段的DNA构建体，所述DNA片段编码多肽融合体，多肽融合体实质上包含如SEQ ID NO5中所示的氨基末端分泌肽，其中所说的Xaa(29)是精氨酸或谷氨酸，Xaa(31)是精氨酸或谷氨酰胺，Xaa(33)是甘氨酸，Xaa(34)是连接到144到335个氨基酸的TPO多肽上的丙氨酸或精氨酸，其中所说的第一DNA片段可操作地连接到一个或多个附加DNA片段上以利于其转录。在一个实施方案中，TPO多肽包含144到191个氨基酸残基。在另一个实施方案中，TPO多肽是人TPO多肽。在另一个实施方案中，TPO多肽包含选自下组序列的氨基酸序列，所述序列如SEQ ID NO4所示的从丝氨酸(22)到缬氨酸(173)，丝氨酸(22)到精氨酸(185)，丝氨酸(22)到天冬酰胺(193)或丝氨酸(22)到谷氨酰胺(235)的序列。在另一个实施方案中，DNA构建体还包含选择性标记。第三方面，本专利技术提供了包含以上公开的DNA构建体的培养的真核细胞。在一组实施方案中，细胞是酵母细胞，如酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。在另一个组实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如啮齿动物细胞或肾细胞。本专利技术的第四方面提供了产生血小板生成素多肽的方法，此方法包括培养如上所公开的真核细胞(其中所说的细胞表达第一DNA片段，TPO多肽从细胞中分泌)和选择性地回收TPO多肽。参照下列详细描述，会明显看到本专利技术的这些或其它方面。专利技术详述在详细地描述本专利技术前，定义本文所用的术语可能是有用的。等位变异体通过突变产生的基因的替代形式或由突变的基因编码的变异多肽。基因突变可以是沉默的(编码的肽无变化)，或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。cDNA互补DNA，通过信使RNA模板、这样的分子的克隆或扩增拷贝的逆转录制备。互补DNA可是单链或双链。表达载体线性或环状DNA分子，该DNA分子包含编码目的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ构建体，该构建体包含：编码多肽融合体的第一ＤＮＡ片段，所述融合体包含连接到血小板生成素（ＴＰＯ）多肽上的氨基－末端分泌肽，所述连接的肽和多肽限定一个在它们的接合处的蛋白水解的裂解位点；和一个或多个附加的ＤＮＡ片段，这些片段 可操作连接到所说的第一ＤＮＡ片段上以利于其转录，其中所说的分泌肽选自：天然哺乳动物的组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）分泌肽；和为增加接合处蛋白水解裂解而修饰的哺乳动物ｔ－ＰＡ分泌肽。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DC弗斯特，MD荷彼尔，RD霍里，
申请(专利权)人：津莫吉尼蒂克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]