用于高表达细胞株开发的载体的构建及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种pSGS载体及其在高表达细胞株开发中的应用。该载体的构建首先基于新霉素抗性筛选基因NEO，通过联合弱化筛选基因表达和增强目的基因表达的策略构建表达载体pSNEO，鉴于GS系统的扩增功能，设计引物用发夹结构序列与GS基因替换pSNEO载体的发夹结构序列与NEO基因，得到筛选高表达稳转细胞株的通用载体pSGS。本发明专利技术构建的pSGS载体可以方便快速的完成目的基因的稳定高表达细胞株的构建，为大分子重组蛋白的制备提供了新的工具。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种pSGS载体及其在高表达细胞株开发中的应用。该载体的构建首先基于新霉素抗性筛选基因NEO，通过联合弱化筛选基因表达和增强目的基因表达的策略构建表达载体pSNEO，鉴于GS系统的扩增功能，设计引物用发夹结构序列与GS基因替换pSNEO载体的发夹结构序列与NEO基因，得到筛选高表达稳转细胞株的通用载体pSGS。本专利技术构建的pSGS载体可以方便快速的完成目的基因的稳定高表达细胞株的构建，为大分子重组蛋白的制备提供了新的工具。【专利说明】用于高表达细胞株开发的载体的构建及应用
本专利技术涉及生物制药基因工程表达技术，具体涉及一种用于高表达细胞株开发的载体的构建及应用。
技术介绍
哺乳动物细胞高效表达系统及高表达工程细胞株的获得是基因工程药物研究和生产的瓶颈，而表达载体和宿主细胞是哺乳动物细胞表达系统的两个基本组成部分。目前用于制备基因工程药物的表达系统包括以大肠杆菌为主要宿主细胞的原核表达系统和以酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞为宿主的真核表达系统。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，是为数不多的可进行高密度悬浮培养的动物细胞之一。CHO细胞表达的外源基因产物与天然蛋白在结构、糖基化类型和方式上几乎相同，且能正确组装成多亚基蛋白，并可大规模、高密度培养。但是该细胞系在表达外源基因时存在着培养成本高、周期长、表达量低等问题。因此，建立哺乳动物细胞高效表达系统包括高表达载体构建、高表达工程细胞株的获得、生物反应器无血清高密度培养工艺以及目标蛋白的分离纯化工艺，是生物制药工业研究和生产的关键技术。本专利技术就哺乳动物细胞高表达载体的构建做了进一步研究。目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰的效率影响。构建一个高表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位点的优化、转录与翻译效率的提高以及目的基因的拷贝数的增加等方面综合考虑。为了获得高表达细胞株，一般都是通过将携带目的基因及筛选基因的真核表达载体转染进细胞后随机整合到基因组中实现目的基因的稳定表达，通过筛选基因的筛选，得到稳定的转染子。常用的真核筛选基因有NEO基因、GS基因等。NEO基因是一种常用的获得稳定表达细胞株的筛选基因，编码氨基糖苷磷酸转移酶，可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，是稳定转染最常用的选择试剂。当NEO基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动NEO基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。目的基因的扩增常采用目的基因和选择标记基因共扩增的方法，如二氢叶酸还原酶(dhfr)和/或，谷氨酰胺合成酶(GS)是常用的扩增基因。GS扩增基因时一种显性基因扩增选择标志基因。在无外源性谷氨酰胺的条件下，只有整合入外来GS基因的细胞才能生存并形成克隆。谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量时，利用细胞内的氨和谷氨酰胺，在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养下，加入谷氨酰胺合成酶的移植物(Methionine sulphoximine,MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因扩增，达到提供目的基因表达水平的目的(Bebbington CR, Renner G,Thomson S,et al,Biotechnology.1992 ；10 (2):169:175.)?应用GS基因扩增系统通常只需1-2轮MSX加压筛选，即可获得高表达细胞株，可以避免多轮筛选来实现基因扩增所导致的筛选压力增加(Brown et al., Cytotechnology9:231-236)，并且在含有GS基因的细胞株中也可获得有效的基因扩增。另外，应用GS基因扩增系统可减少细胞产生的氨。因此，GS基因在构建一种适用于哺乳动物细胞，尤其是CHO细胞的高效表达载体在工业生产中意义重大。在细胞中表达水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现。由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。为了得到高表达细胞株，借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达目的基因。必须的顺式作用元件包括:真核启动子、增强子、加尾信号序列等，此外还包括一些特定的5'端非翻译区或3'端非翻译区。尤其是mRNA5'端非翻译区的发夹(hairpin)结构是一类非常重要然而又常常受到忽视的瞬时作用元件。如果mRNA的翻译起始密码子ATG附近存在稳定的发卡结构，从而影响到翻译起始效率，尤其是那些非常稳定的发卡的存在会完全抑制翻译起始。同时也有报道表明，当5'非翻译区存在富含G-C配对的莖环(stem-loop)结构时,翻译起始复合体很难在体外组装成功，从而影响翻译的起始(PestovaTV, KolupaevaVG.The roles of individual eukaryotic translationinitiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection.Genes Dev.2002，16(22):2906-2922.)。在真核表达载体中，常用的真核启动子为巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)、猴空泡病毒 40 (Simian virus 40, SV40)启动子、小鼠巨细胞病毒(Mouse cytomegalovirus,mCMV)启动子等。有研究表明:在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR(Rous肉瘤病毒基因)启动子的10倍和30倍左右，在之前的研究中我们通过一个比较强的启动子如CMV promoter来驱动目的基因的表达，和一个稍弱的启动子如SV40 promoter来表达筛选基因，但是最后形成的克隆仍是很多，从成千上万个转染子中筛选高表达细胞系仍然是很困难的，通常需要耗费很长时间。`选择基因(如neo、dhfr)的弱化表达,使大量整合在低表达整合位点的细胞由于选择标记基因表达量不够而在选择培养基条件下死亡，只有那些少量整合在转录活跃区的细胞由于表达足够的选择基因产物而存活下来形成克隆。在弱化选择基因的表达上，本领域的研究者做了很多尝试:(I)通过基因突变来削弱筛选基因的功能(Sautter K, EnenkelB.Bioeng.2005 Mar 5; 89 (5): 530-8.); (2)通过改造起始密码子邻近的基因序列来弱化筛选基因的表达(Reff，US Patent N0.5，733，799，1998 ); (3)通过对起始密码子本身进行改造，使筛选基因的起始密码子具有比较低的翻译起始效率，之后连接的目的基因的起始密码子为优化的密码子，从而提高目的基因的表达(Van Blokland et al.JBiotechnol.2007 Feb I;本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真核表达载体，该载体是以pTSE载体为基础改造获得，其特征在于，该载体包括表达弱化的筛选基因表达框和表达增强的目的基因表达框，该载体被命名为pSGS。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志刚，孟艳敏，王康，高震，郭晶晶，彭博，白先宏，
申请(专利权)人：北京东方百泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：