制备美登木素生物碱抗体缀合物的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备美登木素生物碱抗体缀合物的方法。本发明专利技术提供的制备与细胞毒性剂化学偶联的抗体的方法包括使连接体与抗体共价连接、纯化步骤、使细胞毒性剂与抗体缀合和随后的纯化步骤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制备相当高纯度和稳定性的缀合物的方法，其中所述缀合物包含与药物化学偶联的细胞结合剂。
技术介绍
随着更有效地靶向并杀灭癌细胞的药物开发，癌症治疗取得显著的进步。为了这个目的，研究人员利用癌细胞选择性表达的细胞表面受体和抗原，来开发基于抗体的药物，所述抗体与肿瘤特异性或肿瘤相关性抗原结合。在这点上，已将细胞毒性分子例如细菌和植物毒素、放射性核素和某些化学治疗药物与单克隆抗体化学连接，所述单克隆抗体与肿 瘤特异性或肿瘤相关性抗原结合(参见，例如，国际专利申请WO 00/02587、WO 02/060955和WO 02/092127，美国专利5，475,092,6, 340，701和6，171，586，美国专利申请公布号2003/0004210A1，和 Ghetie 等，J.1mmunol. Methods, 112:267-277 (1988))。通常将这类化合物分别称为毒素、放射性核素和药物“缀合物”。常常也将它们称作免疫缀合物、放射免疫缀合物和免疫毒素。在药物缀合物与肿瘤细胞结合并释放药物或/和激活药物的细胞毒活性时，发生肿瘤细胞杀灭。药物缀合物所提供的选择性使对正常细胞的毒性降到最低，因此提高了药物在患者中的耐受性。先前已经描述了将抗体与含巯基的细胞毒性剂例如美登木素生物碱缀合的方法(参见，例如，美国专利5，208，020、5，416，064和6，441，163)。例如，美国专利5，208，020和5，416，064公开了制备抗体-美登木素生物碱缀合物的方法，其中首先用异双功能试剂(例如美国专利4，149,003,4, 563，304和美国专利申请公布号2004/0241174A1中所述的)修饰抗体。美国专利5，208，020和5，416，064进一步描述了经修饰的抗体与过量的含巯基的细胞毒性剂在PH 7的缀合，随后经S印hadex G25色谱柱纯化。也描述了用尺寸排阻色谱法(SEC)纯化抗体一药物缀合物(参见,例如，Liu等，Proc. Natl. Acad. Sci(USA)，93:8618-8623(1996)和 Chari 等，Cancer Research, 52:127-131 (1992))。先前描述用于制备抗体一药物缀合物的方法是复杂的，因为它们被用于执行或生产免疫缀合物的累赘步骤所阻碍，与最佳期望的相比，所述免疫缀合物纯度更低或更不稳定。例如，在pH为6. O 6. 5之间的缀合对于生产纯净和稳定的缀合物来说不是最佳的。此外，在这些条件下的缀合反应通常是缓慢和无效率的，导致需要应用过度的时间和材料。改变或消除一个或多个制备步骤，而不损害产物质量例如纯度和/或稳定性，将是理想的。进一步理想的是，具有除迄今为止所述的那些之外的另外的纯化选择，因为一些使用细胞结合剂、连接体和药物的某些组合的选择比使用其它的将更有效。鉴于前文所述，在本领域中存在如下需求开发改进的制备具有相当高纯度和同时具有更大稳定性的细胞结合剂-药物缀合物组合物的方法。本专利技术提供这样的方法。根据本文提供的本专利技术的说明，本专利技术的这些和其它优点以及另外的专利技术特征将是明显的。
技术实现思路
专利技术简要概述本专利技术提供一种制备相当高纯度和稳定性的缀合物的方法，该缀合物包含与药物化学偶联的细胞结合剂。该方法包括(a)用双功能交联试剂与细胞结合剂接触，以使连接体与细胞结合剂共价连接，从而制备第一混合物，该混合物包含其上结合了连接体的细胞结合剂，(b)使第一混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉淀或它们的组合，从而制备纯化的其上结合了连接体的细胞结合剂的第一混合物，(c)通过在pH为大约4至大约9的溶液中将其上结合了连接体的细胞结合剂与药物起反应，以制备第二混合物，该混合物包含(i)通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂、(ii)游离药物和(iii)反应副产物，来使药物与纯化的第一混合物中其上结合了连接体的细胞结合剂缀合，以及(d) 使第二混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉淀或它们的组合，以从第二混合物的其它成分中纯化通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂，从而制备纯化的第二混合物。专利技术详述本专利技术提供一种制备相当高纯度和稳定性的细胞结合剂-药物缀合物的方法。这样的组合物因为该缀合物的高纯度和稳定性可用于治疗疾病。包含细胞结合剂例如与药物如美登木素生物碱化学偶联的抗体的组合物描述于例如美国专利申请公布号2004/0241174A1中。在本上下文中，相当高纯度被认为是(a)大于90%，优选大于95%的缀合物种类为单体，和/或(b)缀合物制备物中游离药物水平小于2%(相对于总药物)。在这方面，本专利技术的方法包括(a)用双功能交联试剂修饰细胞结合剂，以使连接体与细胞结合剂共价连接，从而制备第一混合物，该混合物包含其上结合了连接体的细胞结合剂，(b)使第一混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉淀或它们的组合，以从第一混合物的其它成分中纯化其上结合了连接体的细胞结合剂，从而制备纯化的其上结合了连接体的细胞结合剂的第一混合物，(c)通过在pH为大约4至大约9的溶液中使其上结合了连接体的细胞结合剂与药物起反应，以制备第二混合物，该混合物包含(i)通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂、(ii)游离药物和(iii)反应副产物，来使药物与纯化的第一混合物中其上结合了连接体的细胞结合剂缀合，和(d)使第二混合物经受切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤、选择性沉淀或它们的组合，以除去非缀合的药物、反应物和副产物以及获得相当纯化的细胞结合剂-药物缀合物。优选地，在纯化步骤中利用切向流过滤(TFF，也称为交叉流过滤、超滤和渗滤)和/或吸附色谱法树脂。然而，当TFF用于第一个纯化步骤(步骤b)中，在(步骤c)中缀合应用的PH为6. 0-6. 5，并且于第二个纯化步骤(步骤d)中应用吸附色谱法树脂时，优选吸附色谱法树脂为非离子交换树脂。在另一个优选的实施方案中，TFF用于两个纯化步骤中，或吸附色谱法树脂用于两个纯化步骤中。替代选择地，吸附色谱法树脂用于第一个纯化步骤中，和TFF用于第二个纯化步骤中。TFF和吸附色谱法树脂的组合也可用于第一个和/或第二个纯化步骤中。可以利用任何适合的TFF系统,包括Pellicon型系统(Mi 11 ipore, Billerica, MA)、Sartocon Cassette 系统(Sartorius AG, Edgewood, NY)和Centrasette 型系统(Pall Corp. , East Hills, NY)。可以利用任何适合的吸附色谱法树脂。优选的吸附色谱法树脂包括用于羟磷灰石色谱法、疏水电荷诱导色谱法(HCIC)、疏水作用色谱法(HIC)、离子交换色谱法、混合式离子交换色谱法、固定化金属离子亲和色谱法(IMAC)、染料配体色谱法、亲和色谱法、反相色谱法及其组合的树脂。适用的羟磷灰石树脂的实例包括陶瓷轻憐灰石(I 型和 II 型 CHT, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)> HA Ultrogel羟磷灰石(Pall Corp. , East Hills, NY)和陶瓷氟磷灰石(I型和II型CFT，Bio-RadLabor本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备抗体?细胞毒性剂缀合物的方法，该方法包括下列步骤：(a)用双功能交联试剂接触抗体，以使连接体与抗体共价连接，从而制备第一混合物，该混合物包含其上结合了连接体的抗体,(b)通过在pH为大约4至大约9的溶液中使其上结合了连接体的抗体与细胞毒性剂起反应，使细胞毒性剂与第一混合物中其上结合了连接体的抗体缀合，以制备第二混合物，该混合物包含(i)通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体，(ii)游离细胞毒性剂和(iii)步骤(b)期间产生的反应副产物，以及(c)使第二混合物经受切向流过滤、选择性沉淀、吸附过滤、吸附色谱法或其组合，以从第二混合物的其它成分中纯化通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体，从而制备纯化的通过连接体与细胞毒性剂化学偶联的抗体的第二混合物；其中所述第一混合物不经受纯化。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：戴勇，王勇，晋圣瑾，D·H·梅舒拉姆，G·W·阿姆弗莱特，
申请(专利权)人：伊缪诺金公司，
类型：发明
国别省市：