串联质谱非衍生化法多种氨基酸和肉碱检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种串联质谱非衍生化法多种氨基酸和肉碱检测试剂盒及应用本试剂盒检测氨基酸和肉碱的方法。该试剂盒包括：同位素标准品、氨基酸肉碱释放剂和流动相，其特征在于，所述氨基酸肉碱释放剂为甲醇、水和NaCL的混合物，其中，甲醇、水和Nacl的质量比为80:20:0.8；所述流动相为甲醇、水和甲酸的混合物，其中，甲醇、水和甲酸的体积比为80:20:0.1。本发明专利技术从干血片中释放氨基酸和肉碱所得液体澄清、透明，在减少对串联质谱仪的污染的同时使检测结果更加准确、稳定。

【技术实现步骤摘要】
串联质谱非衍生化法多种氨基酸和肉碱检测试剂盒
本专利技术涉及串联质谱非衍生化法多种氨基酸和肉碱检测试剂盒及其应用。
技术介绍
新生儿遗传代谢病筛查是指在新生儿期对某些危害严重的先天遗传代谢性疾病进行群体筛检，使患儿得到早期诊断和治疗，避免智能残疾的发生，提高人口质量。此类疾病在新生儿期甚至在小婴儿期常缺乏特异性症状，一旦出现症状患儿已发生中枢神经系统的不可逆损伤，失去了治疗良机。而患儿在新生儿期血液内生化、代谢等指标已有变化，因此可利用实验室检测方法做出早期诊断。新生儿疾病筛查是现代预防医学的一项重要内容，对优生优育、提高人口素质具有深远而积极的意义，也是从根本上降低出生缺陷，提高人口质量的重要措施之一。氨基酸和肉碱是参与人体生理代谢的重要物质，这类物质在人体内正常代谢保持一定的水平。这类物质的浓度改变往往提示人体代谢途径发生异常。通过检测这些物质的浓度，结合临床表现，可帮助临床疾病的判断。串联质谱定量检测氨基酸和肉碱的原理：利用同位素内标取代的方法，将待分析物中的氢原子、碳原子等用氚原子或碳13原子置换，形成与待分析物分子结构一致而分子量相差1-9的标准物质。标准物质与样品中的待分析物一起被送入串联质谱仪中检测。被分析物的浓度与通过串联质谱检测的离子丰度成正比，根据已知浓度的内标准品的离子丰度与被分析物的离子丰度，可得到被分析物浓度。随着筛查疾病种类的增多，临床对遗传代谢病诊断和鉴别诊断的要求在增加。近年来，串联质谱仪的研究和发展，使串联质谱技术成为遗传代谢病的常规诊断工具。串联质谱技术在1990年就已应用于新生儿筛查，迄今为止已有30多个国家和地区使用串联质谱筛查新生儿遗传代谢疾病，筛查覆盖率基本达到90％以上。如美国，到2007年，已经全面普及了液相串联质谱技术，美国健康资源与服务管理部近年来也公布了29种首要筛查的新生儿疾病，包括瓜氨酸血症、枫糖尿病、同型半胱氨酸尿症、丙酸血症等；在英国、德国、澳大利亚、韩国、日本和中国台湾等国家和地区也已将串联质谱新生儿筛查列为法定筛查项目，筛查覆盖率基本达到90％以上。
技术实现思路
基于本专利技术提供一种串联质谱非衍生化法多种氨基酸和肉碱检测试剂盒。试剂盒检测干血片中氨基酸和肉碱含量，可作为评估新生儿遗传代谢病的基础。本试剂盒包括：同位素标准品、氨基酸肉碱释放剂和流动相，其特征在于，所述氨基酸肉碱释放剂为甲醇、水和NaCL的混合物，其中，甲醇、水和Nacl的质量比为80:20:0.8；所述流动相为甲醇、水和甲酸的混合物，其中，甲醇、水和甲酸的体积比为80:20:0.1本专利技术提供了一种使用串联质谱非衍生化法多种氨基酸和肉碱检测试剂盒检测多种氨基酸和肉碱的方法，该方法包括：(1)使用同位素标准品和氨基酸肉碱释放剂制备工作溶液；(2)干血片打孔加样；(3)氨基酸肉碱释放；(4)上清夜转移并离心；(5)上机检测。其中氨基酸肉碱释放的条件为：30-35℃下600-650rpm振荡孵育30-40分钟。本专利技术的试剂盒用于串联质谱检测时可达到更高的精密度和准确度。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本专利技术中，所述同位素标准品包括氨基酸同位素标准品和肉碱同位素标准品，均可以为本领域常规使用的标准品，且市售的各种同位素标准品均可以用于本专利技术，如美国剑桥实验室提供的同位素标准品，其种类及浓度如下表1所示：表1氨基酸(AA)浓度肉碱(AC)浓度15N,2-13C-GLY12.50μmol/L2H9-C00.76μmol/L2H4,13C-ARG2.50μmol/L2H3-C20.19μmol/L2H4-ALA2.50μmol/L2H3-C30.038μmol/L2H2-CIT2.50μmol/L2H3-C40.038μmol/L2H8-MET2.50μmol/L2H9-C50.038μmol/L2H8-VAL2.50μmol/L2H3-C80.038μmol/L2H3-LEU2.50μmol/L2H3-C140.038μmol/L2H6-ORN2.50μmol/L2H3-C160.076μmol/L13C6-PHE2.50μmol/L13C6-TYR2.50μmol/L本专利技术中，所述氨基酸肉碱释放剂为甲醇、水和NaCL的混合物，其中，甲醇、水和Nacl的质量比为80:20:0.8本专利技术中，所述流动相为为甲醇、水和甲酸的混合物，其中，甲醇、水和甲酸的体积比为80:20:0.1本专利技术中，提供的使用上述试剂盒检测多种氨基酸和肉碱的方法包括以下步骤(1)使用同位素标准品和氨基酸肉碱释放剂制备工作溶液；(2)干血片打孔加样；(3)氨基酸肉碱释放；(4)上清夜转移并离心；(5)上机检测。其中氨基酸肉碱释放的条件为：30-35℃下600-650rpm振荡孵育30-40分钟。使用本专利技术的串联质谱非衍生化法多种氨基酸和肉碱检测试剂盒检测新生儿干血片中氨基酸和肉碱的浓度的准确度和精密度如下表2所示。表2样品平均回收率CV％ALA110.5％10.9％ARG93.6％9.5％CIT96.2％9.1％GLY95.4％10.0％LEU118.5％4.9％MET105.0％4.5％ORN99.1％2.8％PHE96.4％3.3％TYR99.6％5.1％VAL114.8％5.2％C089.8％3.2％C296.3％6.5％C393.5％5.2％C496.9％5.9％C596.6％6.6％C5DC99.3％7.5％C6105.9％9.2％C885.4％8.5％C10104.1％8.9％C1296.5％7.1％C1493.4％7.3％C1696.1％4.9％C1899.7％5.8％实施例1步骤1：使用同位素标准品和氨基酸肉碱释放剂制备工作溶液，将同位素标准品用氨基酸肉碱释放剂稀释一百倍即为工作溶液。步骤2：使用自动或手动打孔器在干血斑上将滤纸血片打孔，并将滤纸血片移入提供的V型截底的洁净微孔板的板孔内。纸盘的直径应约为3.2mm。每个板孔只加入一张滤纸片。使用多道移液器以反向加样法给每个含有滤纸血片的板孔内添加100μL的日常工作溶液。用粘性塑料封套覆盖微孔板，确保密封良好，将挥发量降低到最小。步骤3：将微孔板置于孵育振荡器内，在30℃条件下振荡35分钟。微孔板振荡的速度范围为600rpm。步骤4：从每个板孔中将75μL溶液转移到V型底微孔板内，置于96孔板离心机中5000rpm离心5分钟。步骤5：上机检测。将板放入自动进样器中，启用应用软件，建立样品列表，选择正确的采集方法，检测。根据此方法在串联质谱仪器WatersTQD上的质谱条件液相泵梯度及质谱仪条件以上详细描述了本专利技术的优选实施方式，但是，本专利技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本专利技术的技术构思范围内，可以对本专利技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种串联质谱非衍生化法多种氨基酸和肉碱检测试剂盒，该试剂盒包括：同位素标准品、氨基酸肉碱释放剂和流动相，其特征在于，所述氨基酸肉碱释放剂为甲醇、水和NaCl的混合物，其中，甲醇、水和Nacl的质量比为80:20:0.8；所述流动相为甲醇、水和甲酸的混合物，其中，甲醇、水和甲酸的体积比为80:20:0.1。

【技术特征摘要】
1.一种串联质谱非衍生化法多种氨基酸和肉碱检测试剂盒，该试剂盒包括：同位素标准品、氨基酸肉碱释放剂和流动相，其特征在于，所述氨基酸肉碱释放剂为甲醇、水和NaCl的混合物，其中，甲醇、水和Nacl的质量比为80:20:0.8；所述流动相为甲醇、水和甲酸的混合物，其中，甲醇、水和甲酸的体积比为80:20:0.1。2.使用权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，李晓宇，朱保伟，颜世翠，张红梅，翟红利，张淑敏，杨小平，
申请(专利权)人：山东国际生物科技园发展有限公司，烟台赛泽医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37