纯化小模块免疫药物蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了基于羟基磷灰石层析的从含有高分子量(HMW)团聚体和其他杂质的蛋白制备物纯化或回收蛋白，特别是小模块免疫药物(SMIPsTM)蛋白的方法。在一些实施方案中，所述羟基磷灰石层析与亲和层析和/或离子交换层析组合使用。在一些实施方案中，根据本发明专利技术的创造性的方法包含不超过3个层析步骤。本发明专利技术还提供了根据本发明专利技术纯化的诸如SMIPsTM的蛋白和含有相同蛋白的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请参考本申请要求2009年3月11日提交的美国临时专利申请第61/159，347号的权益， 其内容整体援引并入本文。
技术介绍
通常，当生产药用蛋白时，在其可以用于诊断应用、治疗应用、应用细胞生物学和功能研究之前，必须从蛋白制备物去除污染物。例如，从培养细胞收获的蛋白制备物常含有不需要的组分，如细胞产生的蛋白的高分子量(HMW)团聚体。在给药时高分子量团聚体可以通过引起补体激活或过敏反应而不利地影响产品安全性。此外，团聚体可以通过引起产物产量减少、峰加宽和活性丢失来阻碍制造过程。与抗体和其他治疗性蛋白相比，小模块免疫药物(SMIP )蛋白属于相对较新种类的药物蛋白。因此，由于对这类型蛋白缺乏认识，SMIP 蛋白的纯化特别具有挑战性。此外， SMIP 蛋白具有高聚集倾向。例如，细胞培养物中HMW团聚体的百分率可以高达50-60%。专利技术概述本专利技术提供了纯化含有HMW团聚体的蛋白的有效方法。本专利技术涵盖了以下发现， 利用不超过3个层析步骤可以从含有高百分率HMW团聚体(例如，超过50-60%)的蛋白制备物纯化小模块免疫药物蛋白。因此，根据本专利技术的创造性的方法减少了柱步骤的数量， 导致加工时间显著减少并且产物产量显著提高。本专利技术特别有益于纯化小模块免疫药物蛋白。本专利技术的方法还可以用于纯化其他蛋白，特别是那些具有聚集倾向的蛋白。在一方面，本专利技术提供了从含有高分子量团聚体的蛋白制备物，其包括在操作条件下使所述蛋白制备物进行羟基磷灰石层析的步骤，使得所述纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于4%的团聚体(例如，少于3. 5%,3%,2. 5%, 2%、1.5%、1%、0.8%、0.6%、0.5%、0.4%、0.2%或0. 1% )。在一些实施方案中，根据本专利技术的方法包含不超过3个层析步骤。在一些实施方案中，所述操作条件包括在磷酸盐缓冲液中从羟基磷灰石层析柱洗脱所述小模块免疫药物蛋白。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液是无内毒素的。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液是无热原的。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液包含磷酸钠、磷酸钾和/或磷酸锂。在一些实施方案中，合适的磷酸盐缓冲液含有在lmM-50mM浓度范围的磷酸钠。在一些实施方案中，合适的磷酸盐缓冲液还含有在100mM-2. 5M浓度范围的氯化钠。在一些实施方案中，合适的磷酸盐缓冲液含有在2mM-32mM浓度范围的磷酸钠和在IOOmM-L 6M浓度范围的氯化钠。在一些实施方案中，合适的磷酸盐缓冲液具有6. 5-8. 5 范围的PH。在一些实施方案中，所述操作条件包括通过NaCl梯度从羟基磷灰石层析柱洗脱小模块免疫药物蛋白。在一些实施方案中，所述操作条件包括通过NaCl分步洗脱方法从羟基磷灰石层析柱洗脱小模块免疫药物蛋白。在一些实施方案中，所述操作条件包括通过磷酸盐梯度(例如，线性磷酸盐梯度)从羟基磷灰石层析柱洗脱小模块免疫药物蛋白。在一些实施方案中，所述羟基磷灰石层析使用含有I型或II型陶瓷羟基磷灰石树脂的柱。在一些实施方案中，所述柱含有I型陶瓷羟基磷灰石树脂。在一些实施方案中，适合羟基磷灰石层析的树脂直径为ι μ rn-l, 000 μ m。在一些实施方案中，适合羟基磷灰石层析的树脂直径为10 μ m-100 μ m。在一些实施方案中，所述方法还包括在羟基磷灰石层析步骤之前通过亲和层析纯化蛋白制备物的步骤。在一些实施方案中，所述亲和层析步骤使用结合至免疫球蛋白恒定结构域的蛋白吸收剂。在一些实施方案中，所述亲和层析使用结合至免疫球蛋白可变结构域的蛋白吸收剂。在一些实施方案中，适合本专利技术的蛋白吸收剂结合至VH3结构域或与VH3 同源的结构域(例如，来自VH3家族的结构域)。在一些实施方案中，适合本专利技术的蛋白吸收剂包含A蛋白。在一些实施方案中，所述亲和层析使用MabklectTMrfr0tein A树脂柱。 在一些实施方案中，根据本专利技术的方法还包括加入添加剂(例如，PEG和/或其他非离子型有机聚合物)以促进结合至蛋白吸着剂的步骤。在一些实施方案中，所述亲和层析步骤包含利用洗涤缓冲液洗涤亲和层析柱，所述洗涤缓冲液包含Hepes、氯化钠、氯化钙、精氨酸、Tris、氯化镁、组氨酸、尿素、咪唑、一种或多种有机溶剂(例如，乙醇、甲醇、丙二醇、乙二醇、丙醇、异丙醇和丁醇)和/或去污剂 (例如，离子型或非离子型)。在一些实施方案中，所述亲和层析步骤包含利用洗脱缓冲液从亲和层析柱洗脱小模块免疫药物蛋白，所述洗脱缓冲液包含Hepes、磷酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、氯化镁、尿素、丙二醇、乙二醇、一种或多种有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、苯二甲酸和水杨酸)和/或精氨酸。在一些实施方案中，所述洗脱缓冲液还包含选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁及其组合的盐。在一些实施方案中， 所述盐浓度范围为ImM-lM。在某些实施方案中，所述盐浓度范围为lmM-500mM。在某些实施方案中，所述盐浓度范围为ImM-IOOmM在一些实施方案中，根据本专利技术的方法还包含利用阴离子交换层析树脂通过阴离子交换层析纯化蛋白制备物的步骤。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法还包含在亲和层析之后但是在羟基磷灰石层析步骤之前通过阴离子交换层析纯化蛋白制备物的步骤。在一些实施方案中，根据本专利技术的方法还包含加入添加剂以增强小模块免疫药物蛋白和/或杂质结合至阴离子交换层析树脂的步骤。在一些实施方案中，加入的添加剂诱导一种或多种污染物或杂质从蛋白制备物沉淀。在一些实施方案中，通过过滤从蛋白制备物去除沉淀的污染物。在一些实施方案中，合适的添加剂为或含有非离子型有机聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、纤维素、葡聚糖、淀粉和/或聚乙烯吡咯烷酮)。在一些实施方案中，所述方法还包含在亲和或阴离子交换层析之前将蛋白制备物应用于深层滤器(cbpth filter)的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包含一个或多个过滤步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个过滤步骤包含病毒保留过滤步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个过滤步骤包含超滤和/或渗滤步骤。在一些实施方案中，所述蛋白制备物是从培养的细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、无细胞培养基、转基因动物或植物制备的。在一些实施方案中，所述蛋白制备物为细胞培养基制备物。在一些实施方案中，所述培养基制备物含有从培养细胞分泌的小模块免疫药物蛋白。在某些实施方案中，所述培养细胞为CHO细胞。在某些实施方案中，所述培养基制备物是从大型生物反应器制备的。在一些实施方案中，待纯化的蛋白制备物含有细胞提取物。在一些实施方案中，待纯化的蛋白制备物是从包涵体制备的。在另一方面，本专利技术提供了从含有高分子量团聚体的蛋白制备物，所述方法通过使所述蛋白制备物在操作条件下进行(a)亲和层析和/或离子交换层析(例如，一个或两个离子交换层析步骤)，和(b)羟基磷灰石层析，使得纯化的小模块免疫药物蛋白含有少于4% (例如，少于3. 5%,3%,2. 5%,2%U. 5%U%>0. 8%, 0.6%,0.5%,0.4%,0.2%,0. 1% )的团聚体。在一些实施方案中，使所述蛋白制备物进行(al)亲和层析、(^)离子交换层析和(b)羟基磷灰石层析。在一些实施方案中，使所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·加洛，S·孙，J·E·布思，J·科米尔，D·拉卡斯，A·诺伊斯，
申请(专利权)人：惠氏有限责任公司，
类型：发明
国别省市：