转基因动物模型制造技术

本发明专利技术涉及转基因非人动物，特别是转基因啮齿动物，但尤其地转基因小鼠，其允许转基因表达的同时、组织特异性和时间控制性调控并且可用作研究参与某些疾病例如癌症但特别地肺癌的起始和进展的连续步骤的工具。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转基因动物模型本专利技术涉及允许转基因表达的同时、组织特异性和时间控制性(temporally-control led )调控的转基因非人动物，特别是转基因啮 齿动物。这样的模型可用作研究参与某些疾病例如癌症，特别是肺癌 的起始和进展的连续步骤的工具。例如转基因小鼠模型的转基因非人动物模型已成为研究涉及某 些人疾病状态的分子和生理过程，特别地涉及致癌性的分子和生理过 程的不可替代的工具。虽然用于开发常规转基因小鼠模型的基因破坏 和基因替代策略适合于产生无效突变体或功能获得性突变体，但都对 建立由多基因病因学(polygenic etiology)和环境影响引起的疾病例 如癌症作为"获得性"疾病的模型不理想。此类已知的策略产生种系 突变(germline mutation)。因此，在发育的早期阶段起始二次应答(secondary response)的级联反应的潜能是很重要的。这些应答， 即使在未暴露于压力的生物中是表型沉默的，但在成年小鼠中可相当 大地改变行为以应对额外的攻击。虽然该信息本身是吸引人的，但在 发育中使转基因沉默并且在成体中诱导其表达提供了不受潜在的发育 扰乱复杂化的、潜在地更合适的环境。此外，大多数癌症是散发性的， 并且致癌作用通常是组织或空间特异性的。常规转基因小鼠在完整的 动物中携带组成型转基因，其产生与在散发性癌症的起始过程中发现 的极不相同的微环境，其中少数肿瘤细胞被许多正常细胞包围，所述 正常细胞可通过细胞-细胞接触或旁分泌信号传导维持(keep )初始癌 细胞。流行病学数据已清楚地表明香烟烟雾与肺癌的发生在原因上是 相关。过去的分子生物学研究已揭示肺癌中的复杂分子变化。已知， 扰乱整合的信号传导网络(正调控或负调控不同细胞过程以保持肺的 内环境稳定)的完整性导致肺癌的发生。与所有类型的癌症一样，从正常肺细胞转化成恶性肺癌细胞是许多事件组合的结果。虽然香烟烟 雾的致癌作用据认为是多阶段过程，但关于癌症发生真正所需的步骤存在不同的意见。某些遗传或后生畸变(epigenetic aberration)与 致癌作用之间的因果关系通常是不清楚的。这由于关于香烟烟雾诱导 的致癌作用的早期事件知之甚少的事实而复杂化。此外，肺癌起源的 细胞类型和微环境在肿瘤发生中所起的复杂的甚至"矛盾的"作用都 是未知的。用于开发肺癌转基因小鼠模型的最近的策略已从以组成型模式 靶向转基因发展至以诱导型模式在肺中调控基因的表达和消除。这允 许以空间特异性和组织特异性的方式控制基因表达，从而提供用于进 一步研究肿瘤发生的分子基础的更好的平台(由Kwak等人，2004综 述)。在产生条件性转基因小鼠中使用最广的系统是W噬菌体的Cre 重纟且酵和酉良酒酵母(SaccAaro/ffyces cereF/s/ae)的Flp重纟且酵，其 行为彼此非常相似。重组酶Cre(或Flp)通过被称为/oz户(或/V^的 34-bp的不对称多核苷酸的识别促进重组。取决于loxP位点的相对方 向，Cre可催化位于这些位点之间的DNA片段的切除(相同方向)或 插入(相反方向)。获得诱导型基因靶向的已知方法涉及两种类型的 转基因小鼠品系。第 一转基因小鼠品系具有邻侧是方向相同的两个 loxP位点并且以不阻断正常基因活性(两侧装接loxP( floxed)的基 因)的方式放置的靶基因(或基因区段)。第二转基因小鼠品系包含 表达Cre重组酶的转基因。当这两个小鼠品系杂交时，取决于存在于 转基因中的启动子和调控序列，在特定的细胞或组织中缺失两侧装接 loxP的基因并且产生突变。重要地要指出，对于使用Cre/loxP(或 Flp/frt)系统的条件性基因靶向必须满足两个要求。首先，必须以使 其仍然具有功能的方式产生两侧装接loxP的等位基因，其次，Cre表 达的靶向必须受到严格控制。取决于两侧装接loxP的DNA序列， Cre/loxP系统还可用于产生插入。为此目的，可以不仅在给定类型的 细胞中而且在发育的给定时间导入条件性转基因。这些条件性模型可被靶向至获得性疾病的癌症，因为其是散发性。因此，可在小鼠模型的发育的任何阶段进行遗传改变。然而，除了癌症通常是获得性疾病且经历微环境的微妙复杂化(complication) 的事实外，烟草烟雾的致癌作用显示额外的特征。显示吸烟者在停止 吸烟后15至25年几乎与非吸烟者面临相同低的发生肺癌的风险的流 行病学数据强有力地表明香烟烟雾的"可逆性，，或剂量效应。此外， 香烟烟雾施加的损伤对于其作用模式通常是间断性的。已通过鼻内或 气管内施用adeno-cre病毒(表达Cre重组酶的重组腺病毒)开发了 用于肺癌的数个条件性转基因小鼠模型(Jackson等人，2001 ; Meuwissen等人，2001 )。然而，以该方式抑制或激活被耙向的基因 是不可逆的并且在施用后成为组成型，其不能反映香烟烟雾暴露的间 断性性质或停止吸烟后吸烟者中观察到的肺癌的可逆性。这几点产生 了已知的常规和条件性转基因小鼠作为香烟烟雾诱导的肺致瘤性的适 当的疾病模型的相关性的问题。换句话说，目前不存在用于研究香烟 烟雾诱导的肺癌或其他烟雾诱导的疾病的适当的转基因小鼠模型。总之，用于研究香烟烟雾诱导的疾病的理想的或恰当的非人动物 模型应当能够获得l)疾病的获得性性质、2)微环境的复杂化、3)香 烟烟雾暴露的间断性特征，和4)停止后吸烟者中的致癌过程的"可逆 性"性质。本专利技术现提供这样的非人动物模型，其具有上述有利的能力。特 别地，本专利技术提供了包含稳定地整合入其基因组的第一和第二表达盒 的转基因非人动物，其中所述第二表达盒包含在组织特异性启动子控 制下的、编码效应子多肽的多核苷酸。所述(第二)效应子多肽的表 达被第一表达盒的表达产物激活，该表达产物由在诱导型启动子控制 下的多核苷酸编码。根据本专利技术的所有方面和实施方案，优选的转基因非人动物是转 基因啮齿动物。特别优选是转基因小鼠。特别地，本专利技术提供了包含稳定地整合入其基因组的第一表达盒 和第二表达盒的转基因非人动物，其中所述第二表达盒包含在组织特 异性启动子控制下的、编码第二效应子多肽的第二多核苷酸和任选地另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列阻断第二效应子多肽表达以使在非诱导状态下没有不从所述组织特异性启动子的第二效应子多 核苷酸的表达，并且其中所述第一表达盒包含在诱导型启动子控制下的、编码第一效应子多肽的第一多核苷酸，其当被诱导试剂或诱导组 合物诱导并且表达第 一效应子多肽时，通过例如去除对第二表达盒的阻断来激活第二效应子多肽的表达。在本专利技术的一个实施方案中，提供了转基因非人动物，特别是转 基因啮齿动物，尤其是包含稳定地整合入小鼠基因组的第一和第二表 达盒的转基因小鼠，其中所述第二表达盒包含在组织特异性启动子，制下的、编码第二效应子多肽的多核苷酸，其表达被第一表达盒的表 达产物激活，该表达产物由在诱导型启动子，特别是由香烟烟雾或其一种或多种组分诱导的启动子控制下的多核苷酸编码；和目的基因 (goi)，例如肿瘤抑制基因或可适合用于本专利技术的范围内的任何其他 基因，其被整合在动物基因组中并且邻侧是短多核苷酸，所述短多核 苷酸包含重组酶蛋白的识别位点并不干扰目的基因的正常表达，这样go本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含稳定地整合入动物基因组的第一和第二表达盒的转基因动物，其中所述第二表达盒包含在组织特异性启动子控制下的、编码第二效应子多肽的多核苷酸，其表达被第一表达盒的表达产物激活，该表达产物由在诱导型启动子控制下的多核苷酸编码。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩万江，J舒勒，
申请(专利权)人：菲利普莫里斯生产公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]