猪带绦虫TsEP45重组蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供猪带绦虫TsEP45重组蛋白及其应用，尤其涉及猪带绦虫TsEP45重组蛋白作为猪囊尾蚴病特异性诊断抗原的应用和猪带绦虫TsEP45重组蛋白在制备猪囊尾蚴病iELISA检测试剂盒中的应用。本发明专利技术的猪带绦虫TsEP45重组蛋白仅能识别猪囊尾蚴病抗体，而与猪细颈囊尾蚴、旋毛虫、弓形虫等寄生虫病无任何交叉反应，因而可用于猪囊尾蚴病的鉴别诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及猪带绦虫TsEP45重组蛋白及其应用，尤其涉及TsEP45重组蛋白作为猪囊尾蚴病特异性检测抗原的应用和在基于TsEP45重组蛋白的猪囊尾蚴病间接ELISA（iELISA）鉴别诊断试剂盒中的应用。
技术介绍
囊虫病（Cysticercosis）是由猪带绦虫（Taeniasolium）幼虫寄生在人和猪的皮下、肌肉和脑等部位引起的一种食源性的人兽共患寄生虫病。该病不但对养猪业造成巨大经济损失，而且严重威胁着食品安全和人类健康。由于猪感染囊尾蚴后，无明显临床症状，因而该病生前的血清学诊断就显得尤为重要。目前，用于人囊尾蚴病和猪囊尾蚴病血清学诊断的抗原有不少，但无论是虫体抗原还是重组抗原，都与其他寄生虫存在明显交叉反应，尤其是与其亲缘关系很近的猪细颈囊尾蚴病存在严重的交叉反应，导致临床检测常常出现假阳性。因此，寻找与猪细颈囊尾蚴无交叉反应的猪囊尾蚴特异性诊断抗原，是该病诊断和综合防控中的首要问题。研究发现，丝氨酸蛋白酶抑制剂在蠕虫寄生宿主免疫调节中扮演着重要角色，病原体的丝氨酸蛋白酶抑制剂通过干扰宿主免疫调节信号来抑制宿主免疫系统的激活。因此，研究猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的免疫调节功能，无疑将为阐明猪带绦虫在感染宿主过程中的免疫逃避机制和探索新的诊断和疫苗抗原具有指导意义。丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）是一类重要的结构相似、功能多样的球状蛋白酶抑制剂超家族，真核生物、细菌、病毒、古细菌中都发现存在serpin基因。寄生蠕虫的Serpins通过抑制宿主丝氨酸蛋白酶活性，使其免受宿主体内蛋白水解酶类的降解，从而逃避宿主的免疫攻击。已有研究表明，从蛔虫、钩虫等寄生虫分离的丝氨酸蛋白酶抑制剂可抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶等肠道消化酶活性。埃及血吸虫通过虫体表面丝氨酸蛋白酶抑制剂因子与人的胰蛋白酶相结合来降低自身的免疫原性，从而逃脱宿主的免疫攻击。此外，血吸虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂还可作为种特异性抗原，鉴别诊断埃及血吸虫和曼氏血吸虫。因此，Serpin有望成为重要的猪囊尾蚴病诊断和疫苗抗原候选分子，用于该病新型诊断制剂和方法以及新型疫苗的研究。我们的研究已表明，在猪带绦虫的5个serpin基因的表达产物中，无论是特异性还是敏感性TsEP45都明显优于其他serpin和已知的一些诊断抗原，尤其是与猪细颈囊尾蚴几乎不存在任何交叉反应，显示了良好的应用前景。
技术实现思路
为解决现有猪囊尾蚴病诊断抗原存在的交叉反应问题，本专利技术提供了猪带绦虫TsEP45重组蛋白及其应用，尤其涉及TsEP45重组蛋白作为猪病囊尾蚴特异性检测抗原的应用和TsEP45重组蛋白在制备猪囊尾蚴病iELISA检测试剂盒中的应用。本专利技术的第一个目的是提供猪带绦虫TsEP45重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。本专利技术的第二个目的是提供猪带绦虫TsEP45重组蛋白作为猪带绦虫/囊尾蚴检测抗原的应用；所述猪带绦虫TsEP45重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。本专利技术的第三个目的是提供猪带绦虫TsEP45重组蛋白在制备猪囊尾蚴病检测试剂盒中的应用；所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。本专利技术的第四个目的是提供一种猪囊尾蚴病iELISA检测试剂盒，所述试剂盒中包被抗原为猪带绦虫TsEP45重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。作为优选，所述包被抗原的浓度为10μg/ml。作为优选，所述试剂盒中还包括HRP标记的兔抗猪IgG。作为优选，所述试剂盒还包括包被缓冲液，所述包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。作为优选，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为1%BSA。本专利技术的第五个目的是提供一种猪囊尾蚴iELISA检测方法，所述方法不以专利法规定的疾病的诊断和治疗为目的，以纯化的TsEP45重组蛋白1μg于37℃包被酶标反应板1h，封闭液为1%BSA，用PBST充分洗涤后分别加入待测样品和猪阳性血清、猪阴性血清，37℃孵育1h，PBST洗涤三次后，加入1:10000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，充分洗涤后显色，终止反应后测定吸光度，P(阳性)/N（阴性）>2时，为阳性血清，反之，为阴性血清。本专利技术利用猪带绦虫基因组和转录组数据设计TsEP45特异引物，以猪囊尾蚴总RNA为模板，RT-PCR扩增TsEP45基因，并通过生物信息学分析进行鉴定。构建pET-30a-TsEP45重组表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明，TsEP45的ORF由1350个核苷酸组成，编码449个氨基酸残基；其编码氨基酸具有Serpins较为保守的反应中心环（RCL）和特征性结构域，并且存在13个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。TsEP45的表达产物主要以包涵体形式存在，且可与猪囊尾蚴阳性血清发生反应，在55kDa处产生特异条带。以纯化的TsEP45重组蛋白1μg作为间接ELISA的诊断抗原，可特异性检测猪囊尾蚴阳性血清，而与猪细颈囊尾蚴、猪旋毛虫、弓形虫无任何交叉反应。结论：所克隆的片段即为TsEP45，其表达产物可作为猪囊尾蚴病iELISA诊断的特异性抗原。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为猪囊尾蚴的TsEP45基因的PCR扩增结果；其中，M:DNA分子质量标准；1：TsEP45；图2为TsEP45的三级结构预测；图3为TsEP45部分序列与其他寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列对比；图4为不同物种TsEP45的系统进化分析；图5为TsEP45融合蛋白纯化结果；其中，M:蛋白质分子质量标准；1：TsEP45；图6为TsEP45融合蛋白Western-blotting结果，其中，M:蛋白质分子质量标准；1:猪阳性血清；2：猪阴性血清；图7为基于Tsserpins的猪囊尾蚴病特异性检测；图8为基于TsEP45抗原的ELISA检测方法的敏感性和特异性。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例11材料与方法1.1虫株与血清猪囊尾蚴、猪囊尾蚴阳性和阴性血清、猪细颈囊尾蚴血清、猪旋毛虫血清和猪弓形虫血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所蠕虫病课题组保存。质粒小量提取试剂盒、TRIzolReagent、DNA胶回收试剂盒、pMD-T-19(simple)Vector、限制性内切酶BamHI、HindIII、T4DNA连接酶、均购自Takara公司；RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒、PrestainedProteinLadder均购自Thermo公司；大肠杆菌感受态细胞、pET-30a、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、X-Gal、5×蛋白上样缓冲液均购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗猪IgG（HRP）购自Sigma公司；NiSepharose6FastFlow蛋白纯化试剂盒购自GE公司。用TRIzol法提取猪带绦虫囊尾蚴的本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪带绦虫TsEP45重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

【技术特征摘要】
1.猪带绦虫TsEP45重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。2.猪带绦虫TsEP45重组蛋白作为猪囊尾蚴病检测抗原的应用；所述猪带绦虫TsEP45重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。3.猪带绦虫TsEP45重组蛋白在制备猪囊尾蚴病检测试剂盒中的应用；所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。4.一种猪囊尾蚴病间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包被抗原为猪带绦虫TsEP45重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述包被抗原的浓度为10μg/ml。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括HR...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆学农，刘光学，张少华，梁盼红，郑亚东，郭爱疆，王帅，才学鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62