一种检测食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的方法，涉及一种检测旋毛虫和猪囊尾蚴的方法。是要解决目前诊断食源性寄生虫的方法只能检测一种虫体的问题。方法：一、设计旋毛虫和猪囊尾蚴特异性引物，并采用生物素标记，二、样品处理；三、双重PCR扩增；四、探针的修饰；五、将光谱编号为38的微球与修饰后的旋毛虫Ts基因探针耦联，将光谱编号为44的微球与修饰后的猪囊尾蚴Cc基因探针耦联；六、配制微球工作液；七、配制显色液；八、将反应管和阴性对照管置于PCR仪中，杂交，读数，即完成食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的检测。本发明专利技术方法用于检测旋毛虫和猪囊尾蚴。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测旋毛虫和猪囊尾蝴的方法。
技术介绍
旋毛虫病(Trichinosis)是由旋毛形线虫(Trichinella spiralis)寄生于猪等家畜而引起的，除猪外，犬、猫、鼠、兔、牛、羊、人等近150种动物均可感染，由于此病感染来源于摄食了生的或未熟的含旋毛虫包囊的猪肉或其他动物肉，且人感染旋毛虫病可引起死亡，是ー种非常严重的人兽共患寄生虫病，所以在肉品卫生检验中为必检项目。目前除澳大利亚及某些岛屿外，其分布几乎遍及全球各地，已成为一种全球性自然疫源性疾病。肠旋毛虫和肌旋毛虫(即成虫和幼虫)寄生于同一宿主体内，主要致病阶段是肌幼虫且对人体危害很大，严重感染时常能致人死亡。临床症状以发热、全身肌肉酸痛为主，病情严重者可因毒血症、心肌炎及呼吸道并发症而死亡。 猪囊尾蝴病(Cysticercosis cellulosae),是由猪带绦虫的幼虫猪囊尾蝴(Cysticercus cellulosae)寄生于人及猪等动物体内而引起的ー种绦虫蝴病,是ー种非常重要的人兽共患寄生虫病。是肉品卫生检验的重要项目之一，由于含猪囊尾蝴的猪肉不能食用，给畜牧业造成巨大的经济损失。猪囊尾蝴病主要流行于亚、非、拉等ー些国家和地区，囊尾蝴病其分为皮肌型、脑型和眼型三种，其中以脑型囊尾蝴病的发病率为最高。目前诊断食源性寄生虫的方法，虽然操作简便，但大都为一次仅检测ー种虫体，在很大的程度上限制了食源性寄生虫的快速检测和鉴定能力。
技术实现思路
本专利技术是要解决目前诊断食源性寄生虫的方法只能检测ー种虫体的问题，提供一种检测食物中旋毛虫和猪囊尾蝴的方法。本专利技术检测食品中旋毛虫和猪囊尾蝴的方法，按以下步骤进行—、设计旋毛虫Ts基因特异性引物和猪囊尾蝴Ce特异性引物，并对每对引物上游5'端均采用生物素标记，引物序列如下旋毛虫Ts基因特异性引物TsP I :5’ -Biotin-AGGTTCGAAGGCGATCAGATAC-3’，TsP2 :5 ’ -CTGCTCGCCGAGTCTTAAATG-3，，猪囊尾蝴Ce特异性引物CcP3 :5’ -3iotin-AGCGACGAGACGGGCATAC-3’，CcP4:5’ -CGCTGCTGTTGACTGATGATG-3’ニ、样品处理用DNA提取试剂盒提取待检样品的基因组DNA，作为PCR扩增模板；三、双重PCR扩增以步骤一获得的基因组DNA为模板，用步骤ー的引物TsPl、TsP2、CcP3和CcP4进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；四、探针的修饰设计旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蝴Ce基因探针，在旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蝴Ce基因探针的5'端分别加11个T的连接臂，并进行氨基化修饰；五、将光谱编号为38的微球与修饰后的旋毛虫Ts基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000 50000个/ μ L的微球液Α，将光谱编号为44的微球与修饰后的猪囊尾蝴Ce基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000 50000个/ μ L的微球液B ；六、配制微球工作液向300 μ L I. 5 X TMAC杂交液中依次加入I μ L微球液A和I μ L微球液B，混合均匀，即为微球工作液；七、配制显色液用I XTMAC杂交液与SA-PE混合均勻，配制成10 μ g/mL的显色液；ノV、设置反应管和阴性对照管，向反应管中依次加入20 μ L的微球工作液、3 μ L步 骤ニ获得的PCR扩增产物和7 μ L I X TE Buffer,向阴性对照管中加入20 μ L的微球工作液和10 μ L IXTE Buffer，用移液枪混合均匀；然后将反应管和阴性对照管置于PCR仪中，经95°C变性5min，再经50°C杂交20min，然后向每管内加入80 μ L显色液，混合均匀，将反应管和阴性对照管再次置于PCR仪中，50V杂交20min，杂交结束后将管放入LuminexlOO液体悬浮点阵检测仪的铜板中进行读数，即完成食品中旋毛虫和猪囊尾蝴的检测；其中步骤四中旋毛虫Ts基因探针Tsp为5’-CCAACCAGCGATTCGCCGAAGT-3’，猪囊尾蝴Ce基因探针Ccp为5，-CACGAGCTTGAGGCAGACTAGGCACC-3，。 本专利技术的有益效果包括(I)本专利技术方法可以同时检测两种食源性寄生虫(旋毛虫和猪囊尾蝴)，一次即可完成旋毛虫和猪囊尾蝴两种虫体的检测，提高了检测效率。(2)本专利技术的PCR体系为双重PCR，即可同时扩增2个DNA片段。通过引物序列设计、扩增的DNA片段的长度设计、引物体系中各种引物的配比，实现了 2个基因片段的均衡扩增。(3)本专利技术的引物系统中选择关键的上游引物进行标记，扩增得到的每个DNA片段都带有生物素标记，方便检测。(4)本专利技术采用Luminex技木，耦联于荧光微球的探针与PCR扩增得到的基因片段在液相环境中杂交，相比于传统基因芯片的液-固相杂交，杂交效率更高，效果更好。另外，杂交过程可在普通96孔板上进行，可使用多通道排枪进行移液操作，因此整个杂交过程便捷快速，可有效实现高通量检测。附图说明图I为具体实施方式五中旋毛虫的敏感性试验检测结果；图2为具体实施方式五中猪囊尾蝴的敏感性试验检测結果。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式检测食品中旋毛虫和猪囊尾蝴的方法，按以下步骤进行一、设计旋毛虫Ts基因特异性引物和猪囊尾蝴Ce特异性引物，并对每对引物上游5'端均采用生物素标记，引物序列如下旋毛虫Ts基因特异性引物TsPl :5’ -Biotin-AGGTTCGAAGGCGATCAGATAC-3’，TsP2 :5’ -CTGCTCGCCGAGTCTTAAATG-3，，猪囊尾蝴Ce特异性引物CcP3 :5’ -Biotin-AGCGACGAGACGGGCATAC-3，，CcP4 :5’ -CGCTGCTGTTGACTGATGATG-3’ニ、样品处理用DNA提取试剂盒提取待检样品的基因组DNA，作为PCR扩增模板；三、双重PCR扩增以步骤一获得的基因组DNA为模板，用步骤ー的引物TsPl、 TsP2、CcP3和CcP4进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；四、探针的修饰设计旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蝴Ce基因探针，在旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蝴Ce基因探针的5'端分别加11个T的连接臂，并进行氨基化修饰；五、将光谱编号为38的微球与修饰后的旋毛虫Ts基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000 50000个/ μ L的微球液Α，将光谱编号为44的微球与修饰后的猪囊尾蝴Ce基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000 50000个/ μ L的微球液B ；六、配制微球工作液向300 μ L I. 5 X TMAC杂交液中依次加入I μ L微球液A和I μ L微球液B，混合均匀，即为微球工作液；七、配制显色液用I XTMAC杂交液与SA-PE混合均勻，配制成10 μ g/mL的显色液；ノV、设置反应管和阴性对照管，向反应管中依次加入20 μ L的微球工作液、3 μ L步骤ニ获得的PCR扩增产物和7 μ L I X TE Buffer,向阴性对照管中加入20 μ L的微球工作液和10 μ L IXTE Buffer，用移液枪混合均匀；然后将本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的方法，其特征在于检测食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的方法，按以下步骤进行：一、设计旋毛虫Ts基因特异性引物和猪囊尾蚴Cc特异性引物，并对每对引物上游5′端均采用生物素标记，引物序列如下：旋毛虫Ts基因特异性引物：TsP1：5’？Biotin？AGGTTCGAAGGCGATCAGATAC？3’，TsP2：5’？CTGCTCGCCGAGTCTTAAATG？3’，猪囊尾蚴Cc特异性引物：CcP3：5’？Biotin？AGCGACGAGACGGGCATAC？3’，CcP4：5’？CGCTGCTGTTGACTGATGATG？3’二、样品处理：用DNA提取试剂盒提取待检样品的基因组DNA，作为PCR扩增模板；三、双重PCR扩增：以步骤二获得的基因组DNA为模板，用步骤一的引物TsP1、TsP2、CcP3和CcP4进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；四、探针的修饰：设计旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蚴Cc基因探针，在旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蚴Cc基因探针的5′端分别加11个T的连接臂，并进行氨基化修饰；五、将光谱编号为38的微球与修饰后的旋毛虫Ts基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000～50000个/μL的微球液A，将光谱编号为44的微球与修饰后的猪囊尾蚴Cc基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000～50000个/μL的微球液B；六、配制微球工作液：向300μL？1.5×TMAC杂交液中依次加入1μL微球液A和1μL微球液B，混合均匀，即为微球工作液；七、配制显色液：用1×TMAC杂交液与SA？PE混合均匀，配制成10μg/mL的显色液；八、设置反应管和阴性对照管，向反应管中依次加入20μL的微球工作液、3μL步骤二获得的PCR扩增产物和7μL？1×TE？Buffer，向阴性对照管中加入20μL的微球工作液和10μL？1×TE？Buffer，用移液枪混合均匀；然后将反应管和阴性对照管置于PCR仪中，经95℃变性5min，再经50℃杂交20min，然后向每管内加入80μL显色液，混合均匀，将反应管和阴性对照管再次置于PCR仪中，50℃杂交20min，杂交结束后将管放入Luminex100液体悬浮点阵检测仪的铜板中进行读数，即完成食品中旋毛虫和猪囊尾蚴的检测；其中步骤四中旋毛虫Ts基因探针Tsp为5’？CCAACCAGCGATTCGCCGAAGT？3’，猪囊尾蚴Cc基因探针Ccp为5’？CACGAGCTTGAGGCAGACTAGGCACC？3’。...
【技术特征摘要】
1.一种检测食品中旋毛虫和猪囊尾蝴的方法，其特征在于检测食品中旋毛虫和猪囊尾蝴的方法，按以下步骤进行 一、设计旋毛虫Ts基因特异性引物和猪囊尾蝴Ce特异性引物，并对每对引物上游5'端均采用生物素标记，引物序列如下 旋毛虫Ts基因特异性引物TsPl :5’ -Biotin-AGGTTCGAAGGCGATCAGATAC-3’，TsP2 :5’ -CTGCTCGCCGAGTCTTAAATG-3’， 猪囊尾蝴Ce特异性引物CcP3 :5’ -Biotin-AGCGACGAGACGGGCATAC-3’，CcP4 :5’ -CGCTGCTGTTGACTGATGATG-3’ ニ、样品处理用DNA提取试剂盒提取待检样品的基因组DNA，作为PCR扩增模板； 三、双重PCR扩增以步骤ニ获得的基因组DNA为模板，用步骤ー的引物TsPl、TsP2、CcP3和CcP4进行PCR扩增，获得PCR扩增产物； 四、探针的修饰设计旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蝴Ce基因探针，在旋毛虫Ts基因探针和猪囊尾蝴Ce基因探针的5'端分别加11个T的连接臂，并进行氨基化修饰； 五、将光谱编号为38的微球与修饰后的旋毛虫Ts基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000 50000个/ μ L的微球液Α，将光谱编号为44的微球与修饰后的猪囊尾蝴Ce基因探针耦联，并稀释得到浓度为45000 50000个/ μ L的微球液B ； 六、配制微球工作液向300μ L I. 5 X TMAC杂交液中依次加入I μ L微球液A和I μ L微球液B，混合均匀，即为微球工作液； 七、配制显色液用IXTMAC杂交液与SA-PE混合均匀，配制成10 μ g/mL的显色液； ノV、设置反应管和阴性对照管，向反应管中依次加入20 μ L的微球工作液、3 μ L步骤ニ获得的PCR扩增产物和7 μ L I X TE Buffer,向阴性对照管中加入20 μ L的微球工作液和10 μ L IXTE Buffer，用移液枪混合均匀；然后将反应管和阴性对照管置于PCR仪中，经95°C变性5min，再经50°C杂交20min，然后向每管内加入80 μ L显色液，混合均匀，将反应管和阴性对照管再次置于PCR仪中，50V杂交20min，杂交结束后将管放入LuminexlOO液体悬浮点阵检测仪的铜板中进行读数，即完成食品中旋毛虫和猪囊尾蝴的检测；其中步骤四中旋毛虫Ts基因探针Tsp为5’-CCAACCAGCGATTCGCCGAAGT-3’，猪囊尾蝴Ce基因探针Ccp为...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋铭忻，张子群，李巍，付丽君，韩彩霞，李晓云，唐颖，俞昭旸，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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