用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂及其制备方法技术

涉及一种含有抗原或抗体的医药制品，所说的试剂包含试剂１和试剂２，试剂１为胶乳试剂，由克隆于大肠杆菌中的排泄－分泌抗原Ｐ４９，Ｐ４５，Ｐ５３抗原中的至少一种抗原基因体外表达的产物与胶乳配制而成；试剂２为抗人或家畜免疫球蛋白ＩｇＧ或ＩｇＭ抗体致敏的磁性颗粒。用本发明专利技术提供的试剂对人畜旋毛虫病进行检测，其操作简便，只要将试剂及样品混合孵育一定时间，即可读出结果，整个操作时间不超过２５ｍｉｎ，且灵敏度高，结果判断容易、准确。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种含有抗原或抗体的医学或兽医学制品。旋毛虫病是由旋毛形线虫(Trichinella spiralis，简称旋毛虫)引起的一种严重的人畜共患寄生虫病，是全国寄生虫病防治“八·五”计划和2000年规划的防治重点之一；也是食肉卫生检疫的必检项目之一目前该病的检验方法主要有以下几种压片镜检法剪取膈肌(近肝脏的膈肌脚)，重量不少于30～50g，先撕去肌膜，将肉片向两端撸开，对光用眼观察，仔细观察有无一种凸出的卵圆形的针尖大小的膨状物，呈灰白色折光良好的小节结，如有，应剪取小节结压片，仔细观察有无旋毛虫囊包或幼虫；如无，则应剪取24块米粒大小肉粒，同上压片观察。该方法虽简单，但其漏诊、误诊率较高，其阴性率只有50％左右，且不易被病人所接受，所以该方法主要用于病死后的尸检或屠宰后的卫生检疫。免疫学方法该方法包括简单的血清沉淀试验、凝集试验、皮内反应试验及补体结合试验等，但这些方法都存在着检验特异性低的明显不足。近年来发展了胶乳凝集试验(LAT)及酶联免疫吸附检测(ELISA)等方法。(1)胶乳凝集试验(latex agglutination test)取2g膈肌加入胃蛋白酶消化2h，离心收集沉淀，超声处理后取上清液，加胶乳颗粒和抗旋毛虫抗体致敏，然后进行检测，检测可分玻片法或试管法。玻片法--取30uL待检液加10uL胺乳液于玻片上，放入振荡器振荡孵育5min，最后读结果，有胶乳凝块者为阳性。试管法--取100uL待检液加10uL胶乳液于试管内，于室温下搅拌孵育15min后读结果，胶乳浊度下降并在管底有凝块者为阳性。该方法较为简单，快速，其检验灵敏度是压片法的6倍，但该方法需超声破碎仪，且不能定量。(2)酶联免疫吸附检侧(ELISA)试剂盒试剂盒材料包括旋毛虫蚴虫可溶性抗原致敏的PVC载体(ELISA板)、辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)、TMB显色底物。其检验方法为在PVC载体上每孔放0.2mL适当稀释的待检血清，于37℃下放置5min或25℃下放置10min，弃血清，常规洗涤8次后加0.2mL适当稀释的ARP-SPA，于37℃下放置5min，常规洗涤8次，蒸馏水洗涤1次，再加入0.2mL TMB，放置5～10min显色，结果如鲜蓝色为阳性，基本无色为阴性，或590nm比色，以P/N≥2.1为阳性。该方法灵敏度高，准确性和重复性好，且可定量测定，但操作程序繁琐、耗时长，需要酶标记读数。本专利技术的目的旨在提供一种用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂，该试剂采用基因工程产物代替天然抗原，并在胶乳凝集试验的基础上引入磁性颗粒，将该试剂用于人畜旋毛虫病的诊断，具有操作简便，灵敏度高，结果判断容易、准确等优点。本专利技术所说的用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂包含试剂1和试剂2，试剂1为胶乳试剂，即旋毛虫体外排泄-分泌抗原P49,P45,P53中的至少一种抗原基因体外表达的产物致敏的胶乳，由克隆于大肠杆菌中的排泄-分泌抗原P49,P45,P53中的至少一种抗原基因体外表达的产物与胶乳(latex)配制而成。胶乳为商品化的各种颜色的胶乳，颗粒直径最好为0.75～0.90um。其制备方法为1)取0.1～10mg/mL纯化后的P49,P45,P53中的至少一种抗原基因体外表达的产物加上1/5～1/20体积的2％～20％的胶乳颗粒，于室温下振荡，也可以再经超声处理40～80sec以打破团块。2)加入3～4倍体积的1％～2％carbodiimide，于1～10℃下振荡，也可以再经超声处理40～60sec 。 3)加乙酸至终浓度0.5～1.5mol/L以终止反应。4)用磷酸生理盐水缓冲液(即PBS)洗涤。5)沉淀，用牛血清白蛋白-甘氨酸缓冲液重悬至胶乳浓度为0.01％～1％,1～10℃保存备用。试剂2为抗人或家畜免疫球蛋IgG或IgM抗体致敏的磁性颗粒(magnetic beads，又称磁珠)，其制备方法为1)取磁性颗粒用无菌水洗涤一次。2)重悬于无菌水中，加入0.5～1.5倍体积浓度为100～200ug/mL的抗IgG或IgM抗体，于1～10℃下振荡。3)用磁力装置收集磁性颗粒。4)依次用磷酸生理盐水缓冲液、甘氨酸-NaOH和含牛血清白蛋白、吐温-20及氯化钠的Tris封闭缓冲液室温洗涤，再收集磁性颗粒后重悬于含牛血清白蛋白及氯化钠的Tris贮存缓冲液中，至终浓度为4×104～4×107,1～10℃保存备用。将本专利技术提供的试剂用于人畜旋毛虫病的检测，其检验步骤如下，取2～20uL试剂1于0.5mL离心管中(或酶标板的孔内)，加2～20uL用甘氨酸缓冲液(即GBS,0.1mol/L甘氨酸，0.9％NaCl(PH8.2)) 1∶10～1∶640稀释过的待检血清，再加2～20uL试剂2及2～20uL的甘氨酸缓冲液，于37℃振荡5～30min(或室温下10～90min)，然后置于一磁体上0.5～10min，最后观察结果，上清有色者(根据所用胶乳的颜色)为阴性；上清透明者为阳性，也可在一定波长(根据所用胶乳的颜色)下读O.D,P/N≤2.1为阳性。本专利技术将基因工程产物用作抗原，代替现有天然抗原制作方法(即裂解虫体或体外培养虫体后收集体外排泄-分泌抗原)，避免天然抗原制备的生产周期长，各批次质量不均，对接触感染性材料的工作人员构成威胁等缺点，同时在胶乳凝集试验的基础上引入磁性颗粒。用本专利技术提供的试剂对人畜旋毛虫病进行检测，其操作简便，只要将各种试剂及样品混合在一起，孵育一定时间即可，整个操作时间不超过25min，且灵敏度高，结果判断容易、准确，由酶标仪读取O.D值即可定量测定，另外，将不同颜色的胶乳颗粒分别用不同感染因子的抗原致敏，可由一次检验而区分不同感染因子的感染。使用该试剂的检验方法即可适用于畜牧业的养殖场或屠宰场的现场检验，也可应用于医院的临床诊断。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明实施例1，试剂1即胶乳试剂，由旋毛虫体外排泄-分泌抗原P49与胶乳配制而成。其制备方法如下。胶乳试剂的制备取0.2mg/mL经纯化后的P49抗原基因体外表达的产物→1/5体积的3％的胶乳颗粒(直径0.75～0.90um)→室温振荡10min→超声处理80sec以打破团块→3倍体积的1％carbodiimide→2℃振荡过夜→加乙酸(PH4.0)至终浓度0.6mol/L以终止反应→2℃下用PBS(8.4mmol/L Na2HPO4,1.9mmol/L NaH2PO4,150mmol/L NaCl PH7.2)洗涤，缓慢旋转振荡→2000rpm离心10min→缓慢吸出上清，沉淀，用牛血清白蛋白-甘氨酸缓冲液即(0.1mmol/L glycine,0.9％NaCl,1％BSA)重悬至胶乳浓度为0.01％,2℃保存备用。试剂2即磁性颗粒的制备过程磁性颗粒(4×108粒/mL)→无菌水洗涤一次→重悬于无菌水中→加入0.5倍体积200ug/mL的抗IgG抗体→2℃下缓慢振荡24h→磁力装置磁性颗粒→用0.5mL 0.1mol/LPBS(PH8.5)洗涤20min→0.5mL 0.2mol/L甘氨酸-NaOH(50mL0.2mol/L glycine,20mL0.2N NaOH，定容至200mL)室温缓慢洗涤4h→用0.5mL含牛血本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂及其制备方法，其特征在于所说的试剂包含试剂１和试剂２，试剂１为胶乳试剂，由克隆于大肠杆菌中的排泄－分泌抗原Ｐ４９，Ｐ４５，Ｐ５３中的至少一种抗原基因体外表达的产物与胶乳配制而成；其制备方法为：１）取０．１～１０ｍｇ／ｍＬ纯化后的Ｐ４９，Ｐ４５，Ｐ５３中的至少一种抗原基因体外表达的产物加上１／５～１／２０体积的２％～２０％的胶乳颗粒，于室温下振荡，２）加３～４倍体积的１％～２％的ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，于１～１０℃下振荡，３）加乙酸至经浓度０．５～１．５ｍｏｌ／Ｌ以终止反应，４）用磷酸生理盐水缓冲液洗涤，５）沉淀，用牛血清白蛋白甘氨酸缓冲液，重悬至胶乳浓度为０．０１％～１％，１～１０℃留存备用；试剂２为抗人或家畜免疫球蛋白ＩｇＧ或ＩｇＭ抗体致敏的磁性颗粒，其制备方法为：１）取磁 性颗粒用无菌水洗涤一次，２）重悬于无菌水中，加入０．５～１．５倍体积浓度为１００～２００ｕｇ／ｍＬ的抗ＩｇＧ或ＩｇＭ抗体，于１～１０℃下振荡，３）用磁力装置收集磁性颗粒，４）依次用磷酸生理盐水缓冲液、甘氨酸－ＮａＯＨ和含牛血清白蛋白、吐温－２０及氯化钠的Ｔｒｉｓ封闭缓冲液室温洗涤，再收集磁性颗粒后重悬于含牛血清白蛋白及氯化钠的Ｔｒｉｓ贮存缓冲液中，至终浓度为４×１０↑［４］～４×１０↑［７］，１～１０℃保存备用。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋思扬，张伟光，郑忠辉，蔡海松，黄耀坚，林新坚，苏文金，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]