氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法技术

本发明专利技术涉及一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，包括用于特异性结合氧化亚铁硫杆菌的rRNA的分析探针、用于结合在载体上并与分析探针特异性结合的捕获探针以及用于与分析探针特异性结合的信号探针，所述信号探针具有蛋白标记，较佳地，分析探针具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，捕获探针具有如SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列，捕获探针具有生物素标记，信号探针具有如SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列，蛋白标记是荧光素标记。还提供了一种氧化亚铁硫杆菌检测方法。本发明专利技术的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物设计巧妙，可以快速定性定量检测氧化亚铁硫杆菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细菌检测
，更具体地，涉及浸矿细菌检测
，特别是指一种。
技术介绍
氧化亚铁硫杆菌是一种嗜酸硫杆菌，属于极端微生物，在大多浸出场所的都是主要菌种对细菌浸出起主要作用。由于在大型的生物浸矿现场，浸矿作用是由多种菌混合共同作用，由于浸矿的不同阶段对条件控制的变化会导致菌群的变化，必然会对浸矿效率产生影响。但是现阶段对生物浸矿菌群变化研究相对较少，研究方法仅局限于显微镜，PCR技术等，各个方法均具有一定的优点和局限性，例如显微镜计数分析难度较大、费时较长，对操作人员的要求较高，而且在浸矿过程中，很难排除亲缘关系较近的菌种，定性效果不好；定时定量PCR技术价格昂贵，对DNA纯化效率有很高的要求，重复性难等。 虽然国内近年来有报道用改进的三明治杂交方法对藻类进行定性定量检测，但是由于生物浸矿现场浸矿样液混浊、操作条件极端并且非常简陋，还尚未有对氧化亚铁硫杆菌的高效检测方法。因此，需要提供一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，以快速定性定量检测氧化亚铁硫杆菌，且检测方法操作简单、重复性好。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种，该氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物设计巧妙，可以快速定性定量检测氧化亚铁硫杆菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本专利技术的第一方面，提供了一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特点是，包括用于特异性结合氧化亚铁硫杆菌的rRNA的分析探针、用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针，所述信号探针具有蛋白标记。所述分析探针可以具有任何合适的序列，其与氧化亚铁硫杆菌的rRNA特异性结合，较佳地，所述分析探针具有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。所述捕获探针可以具有任何合适的序列，其与所述分析探针特异性结合，可以根据所述分析探针进行设计，较佳地，所述捕获探针具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。所述捕获探针可以通过任何方式固定在载体上，较佳地，所述捕获探针具有生物 T 己 O所述信号探针可以具有任何合适的序列，其与所述分析探针特异性结合，可以根据所述分析探针进行设计，较佳地，所述信号探针具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。所述蛋白标记可以是任何合适的蛋白，较佳地，所述蛋白标记是荧光素标记。在本专利技术的第二方面，提供了一种氧化亚铁硫杆菌检测方法，其特点是，采用上述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物检测氧化亚铁硫杆菌，并具体包括以下步骤(I)将所述分析探针与所述rRNA杂交得到杂交产物；分析探针与rRNA分子杂交后形成DNA/RNA杂合体。(2)在所述杂交产物中加入核酸SI酶消化处理得到消化产物；在SI酶的作用下，单链的DNA或RNA分予以及DNA/RNA杂合体的不匹配部分被消化，留下与目标RNA分子数量上相等的DNA/RNA杂合体；(3)对所述消化产物进行变性处理得到变性产物；将DNA/RNA杂合体变性为DNA单链和RNA单链，变性方法可以采用该领域常用变性技术，例如热变性方法，由于单链RNA非常不稳定，很容易被RNA酶降解掉。(4)将所述变性产物与固定在载体上的所述捕获探针杂交，然后洗涤；杂交后形成DNA/DNA杂合体，洗涤是为了除去非特异性吸附。 (5)加入所述信号探针与所述分析探针杂交，然后洗涤；杂交后形成“三明治”杂交复合体，洗涤同样是为了除去非特异性吸附。(6)加入带酶标记的抗所述蛋白标记的抗体与所述蛋白标记进行杂交，然后洗涤；(7)加入所述酶标记的底物以显色。所述捕获探针可以通过任何方式固定在载体上，较佳地，所述捕获探针通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在所述载体上。所述蛋白标记可以是任何合适的蛋白，较佳地，所述蛋白标记是荧光素标记，所述抗体是抗荧光素标记的抗体。所述酶标记可以是任何合适的酶，较佳地，所述酶标记是辣根过氧化物酶标记，所述底物是四甲基联苯胺。酶和底物组成显色系统，显然，显色系统还可以采用其它显色系统，例如邻苯二胺等。本专利技术的有益效果具体在于(I)特异性好由于工业浸矿现场环境恶劣，浸矿主要菌种一般为极端微生物，生长条件特殊，基于以上条件，国内对浸矿菌种检测非常困难，本专利技术采用分析探针可以特异性识别靶序列，最后通过一系列反应显色，建立吸光度与菌浓之间的标准曲线，准确度可达90%以上，大大提高了检测精准度。(2)灵敏度好最低检测线可达1000个/mL，自养型微生物体型较小，体内16SrRNA也相对较少，该分析探针灵敏度已经很高。(3)稳定性高由于检测过程中设计的分析探针会将细菌体内不稳定的RNA信号转化为等量的DNA信号，将保证RNA分子在整个过程不被降解，其他步骤均是针对DNA进行的，从而大大提闻了检测的稳定性。(4)价格便宜对设备要求低，仅需水浴锅，摇床，离心机，酶标仪等常规仪器，而且优化检测条件后，平均每个样品检测时间段，耗去材料药品费用非常低，非常适用于工业化检测。附图说明图I是采用本专利技术的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物的一具体实施例对不同浸矿细菌检测显色结果。图2是采用本专利技术的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物的一具体实施例对氧化亚硫杆菌检测的标准曲线。具体实施例方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例详细说明，目的在于更好理解本专利技术的内容而非限制本专利技术的保护范围。在本实施例中，采用特异性探针对生物浸矿主要菌种氧化亚铁硫杆菌进行检测，制作其标准曲线，并对其特异性进行验证。I. I氧化亚铁硫杆菌16SrRNA特定区域探针的设计与合成将氧化亚铁硫杆菌16SrRNA序列与其他浸矿细菌序列进行比对，找到在896-965区域的核酸互补，而与其他主要浸矿细菌核苷酸无同源性，确定为特征区域，设计分析探针为·5， -ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTCCGGAATTCTGCAGAGAT-3’ (见SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列);根据上述探针设计合成检测所需其他探针捕获探针为5’-ATCTCTGCAGAATTCCGGACATGTCAA-3’ (见 SEQ ID NO 2 所示的核苷酸序列)，与分析探针的3'端互补，在5'端有生物素(Biotin)标记；信号探针为5’-TTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACAT-3’ (见 SEQ ID NO 3 所示的核苷酸序列)，与分析探针的5'端互补，在5'端有异硫氰酸(FITC)标记。I. 2准备阶段I. 2. I链霉亲和素包被板制备链霉亲和素用包被液配成5 μ g/ml，向微孔板各孔内加入100 μ I，用封口膜封好后于4 °C过夜，次日取出，用PBST洗涤液洗涤3次，再用O. I % BSA (O. Olmol/LPBS7. 2) 250ul，在37°C下封闭60min，最后用PBST洗涤液洗涤3次，干燥后封好于4°C下保存待用，可保存2月。I. 2. 2捕获探针固定化100 μ I (500ηΜ溶于pH 7. 2PBS)捕获探针加入链霉素包被微孔板，于37°C下保温2h，并用洗涤液PBST冲洗3次，随后储存于4°C下。1.2.3细菌胞内物质获取取对数期氧化亚铁硫杆菌显微镜计本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，包括用于特异性结合氧化亚铁硫杆菌的rRNA的分析探针、用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针，所述信号探针具有蛋白标记。

【技术特征摘要】
1.一种氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，包括用于特异性结合氧化亚铁硫杆菌的rRNA的分析探针、用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针，所述信号探针具有蛋白标记。2.根据权利要求I所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述分析探针具有如SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。3.根据权利要求I所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述捕获探针具有如SEQ ID NO : 2所示的核苷酸序列。4.根据权利要求I所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述捕获探针具有生物素标记。5.根据权利要求I所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述信号探针具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。6.根据权利要求I所述的氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物，其特征在于，所述蛋白标记是突光素标记。7.一种氧化亚铁硫杆菌检测方法，其特征在于，采用根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海麟，辛瑜，王武，冯守帅，夏小乐，张玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：