本发明专利技术提供了一种猪带绦虫microRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:n所示，n选自1－150的正整数；或者与SEQIDNO:n中的任何一条序列互补的序列。本发明专利技术还提供了上述的任一所述的猪带绦虫microRNA在制备猪带绦虫疫苗中的应用。还提供了一种抑制猪带绦虫生长发育的组合物。本发明专利技术还提供了一种基因芯片。本发明专利技术首次从猪带绦虫分离获得一类新的microRNA，这些microRNA在猪带绦虫生活史中的表达具有重要意义，可用于影响猪带绦虫幼虫生理功能，发育，分化相关等功能，并为制备猪带绦虫基因工程疫苗以及防治猪带绦虫病提供了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学领域，涉及一种猪带绦虫，具体来说是一种猪带绦虫micoRNA 及其应用。
技术介绍
猪带绦虫是常见的人兽共患寄生虫，人感染猪带绦虫，可引起后果严重的囊尾蚴病(囊虫病)。我国北部和西部地区是较严重的流行区。每年造成的健康危害和畜牧业经济损失上百亿，是影响西部地区社会发展的一个公共卫生问题。目前，可用于猪带绦虫的鉴别方法主要是通过成虫的形态学。但是，由于虫体发育的时期不同，寄生的宿主不同等因素，均对虫体的形态有影响，所以形态学的鉴定有一定的局限性，经常不能将其与牛带绦虫和亚洲带绦虫区分。MicroRNAs (microRNAs)是一类大小长约2(Γ25个核苷酸，内源性的具有调控功能的非编码RNA，在许多真核生物中都曾经被发现。这类RNA的功能主要是参与机体或细胞的调节途径，包括发育、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等过程。在寄生虫研究领域，已有研究表明寄生线虫存在独特的microRNA转录后调控机制，它们可以通过microRNA实现对宿主和自身基因表达模式的精确调控，从而提高感染和自身增殖的几率并逃避免疫监视。通过选择性地抑制或阻断某一特定发育期线虫的发育，从而减少和阻断寄生线虫的传播途径。猪带绦虫特异表达的microRNA有可能成为其免疫预防和化学防治的新分子靶标，为核酸疫苗的制备奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪带绦虫microRNA及其应用，所述的这种猪带绦虫 microRNA及其应用要解决现有技术中的抗蠕虫药物造成的寄生虫抗药性、以及动物产品和环境中含有药物残留的技术问题。本专利技术一种猪带绦虫microRNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:η所示， η选自1 150的正整数；或者与SEQ ID Ν0:η中的任何一条序列互补的序列。进一步的，所述的互补序列为DNA或RNA。进一步的，所述互补序列为经过修饰的DNA或RNA。进一步的，所述互补序列为经过硫代修饰或甲氧基修饰的DNA或RNA。本专利技术还提供了上述的任一所述的猪带绦虫microRNA在制备猪带绦虫疫苗中的应用。本专利技术还提供了一种抑制猪带绦虫生长发育的组合物，含有有效量的至少一个寡核苷酸，所述的寡核苷酸特异性的对应于如SEQ ID NO: 1 150中任一所示的microRNA 序列或者与SEQ ID N0:1 150中的任何一条序列互补的序列。本专利技术还提供了一种基因芯片，包括一个固相载体，在所述的固相载体上固定有至少一个寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性的对应于如SEQ ID NO: 1 150中任一所示的microRNA序列或者与SEQ ID NO: 1 150中的任何一条序列互补的序列。本专利技术所提供的猪带绦虫microRNA均分别克隆猪带绦虫的成虫，成熟的 microRNA序列长度为18-25 nt。对其microRNA进行深度测序，获得猪带绦虫成虫的 microRNA表达谱，通过比对发现，SEQ ID NO 1-140所示的microRNA只在猪带绦虫成虫中表达，而在参照基因组日本血吸虫中不表达。因此，在猪带绦虫体内过量表达SEQ ID N0 1-150分子或采用microRNA反向互补序列抑制SEQ ID NO :1 150的表达将影响猪带绦虫生理功能及器官分化相关的功能。此外，鉴于猪带绦虫与牛带绦虫和亚洲带绦虫的物种相似性，本专利技术所提供的猪带绦虫microRNA及其反向互补序列亦可应该用于影响牛带绦虫以及亚洲带绦虫的生理功能及分化相关的功能。因此，本专利技术猪带绦虫成虫特异性表达的microRNA可用于制备带绦虫疫苗，特别是猪带绦虫疫苗。本专利技术和已有技术相比，其技术效果是显而易见的。本专利技术的猪带绦虫成虫 microRNA可以选择性的抑制或阻断某一特定发育期虫体的发育，从而减少或阻断寄生虫， 尤其是猪带绦虫的传播。本专利技术microRNA制备成为猪带绦虫疫苗时，作为核酸疫苗，避免了传统抗蠕虫药物造成的全球性分布的寄生虫抗药性问题，也不会导致动物产品或环境种内药物的残留。具体实施例方式实施例1microRNA的获得 1.总RNA抽提1)将样本(猪带绦虫成虫孕节一片)放入研体中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50 - IOOmg组织/ml Trizol加入Trizol，转移入离心管；2)加入250μ L氯仿，剧烈振荡10s，使液体充分混勻呈乳白状(无分相现象)后，再室温静置5min ；3)在4°C条件下，以 12000r/min 离心 15min ；4)将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混勻，然后在 4°C条件下静置10- 15min ；5)在4°C条件下，以12000r/min离心15min，小心并尽可能去掉上清；6)用ImL75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁，在4°C条件下，以12000r/min离心8min，然后小心弃去乙醇；7)将RNA沉淀进行干燥(不能完全干燥)处理后，用10μ L RNase - free水将RNA溶解， 直接用于反转录。2.总RNA纯度和完整性检测1)纯度检测取ι μ L RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD 260/0D 280的比值大于1. 8。2)总RNA完整性取RNA样品1 μ L，1%琼脂糖凝胶电泳80 VX 20 min,用凝胶成像系统观察总RNA 5S rRNA, 18S rRNA和^S rRNA条带，三条带条带完整。3. small RNA序列的获得和筛选用15% PAGE胶回收20-30 nt的small RNA，加上5，和3，端接头(购自Illumina公司)后实施RT-PCR (反转录试剂盒购自hvitrogen公司)。产物经6 %TBE PAGE胶纯化后进行Solexa测序。然后屏蔽掉可能为接头序列的部分、测序质量差的序列(例如测序信号很低等)及长度小于18 nt的序列获得clean reads。4. microRNA 的鉴定用 BLAST 程序(NCBI，www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast) M clean reads 与 GenBank 禾口 Rfam database (version 9.0) (http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/microRNA) 进行比对分析，去除非编码RNA序列，包括rRNA，tRNA, snRNA, snoRNA，和other ncRNA ； 通过Repeatmasker (http://www. repeatmasker. org)去除转座子等重复序列；然后搜索 Sanger miRBase (version 13. 0)数据库，寻找序列相似性microRNA。将猪带绦虫所表达的microRNA与已报道的日本血吸虫进行比较，分别屏蔽掉两两共有相关的序列，获得猪带绦虫microRNA (例举150条)。此外，为了提高反向互补序列的作用和细胞内稳定性，上述猪带绦虫特异性 microRNA的反向互补序列可以是DNA或RNA，还可以对反向互补序列进行硫代、甲氧基等修饰。实施例2本专利技术一种基因芯片，包括一个固相载体，在所述的固相本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种猪带绦虫ｍｉｃｒｏＲＮＡ，其特征在于：其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ｎ所示，ｎ选自１～１５０的正整数；或者与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ｎ中的任何一条序列互补的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周晓农，陈家旭，艾琳，陈木新，陈韶红，张永年，田利光，蔡玉春，张玲玲，周洋，徐民俊，朱兴全，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。