一种蛇毒灭活方法及由此制得的灭活蛇毒技术

本发明专利技术涉及一种蛇毒灭活方法，其采用蛋白烷基化试剂烷基化蛇毒，从而灭活蛇毒。较佳地，烷基化在可逆变性条件下进行，烷基化是在20-40℃避光培育1-10小时完成，蛋白烷基化试剂是碘乙酰胺、碘乙酸或碘乙酸盐，烷基化在蛇毒用缓冲液中进行，蛇毒的浓度为每毫升0.01毫克-100毫克，蛇毒是蝰蛇或蝮蛇、眼睛蛇、五步蛇、银环蛇蛇毒。还涉及由此制得的灭活蛇毒，本发明专利技术的蛇毒灭活方法设计新颖，可以使得蛇毒蛋白构象不发生明显变化，保留天然蛇毒的关键性抗原表位，从而灭活后的蛇毒免疫后可以产生高效价中和抗体，且降低免疫用的抗原用量，减少副反应，高滴度中和抗体产生迅速，适于大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及毒性灭活
，特别涉及蛇毒灭活
，具体是指一种蛇毒灭活方法及由此制得的灭活蛇毒。
技术介绍
抗蛇毒血清的研究已有100多年的历史。首先应用于临床的是在印度制备的抗眼镜蛇毒血清。以后，世界上就有许多科学工作者从事这一研究工作。目前，世界上有20多个国家30多个机构利用60多种毒蛇的蛇毒生产抗蛇毒血清，现有近百种单价和多价抗蛇毒血清在临床上使用。但是到目前为止，均存在免疫效价低，有效抗体少，需要使用的剂量大的缺陷，从而导致在临床应用中副反应大这一重大问题。我国早在1923年，台湾地区研制抗蛇毒血清。1969年，上海生物制品研究所开展抗蛇毒血清的研制工作。第一个对象是对分布广、危害大、占蛇伤大多数的蝮蛇进行研究， 将抗原(蛇毒)用化学方法进行减毒处理，然后对马匹进行免疫，获得满意的抗毒素效价。 在1970年，由浙江医科大学和浙江省中医研究所承担了临床验证，结果证明精制抗蝮蛇毒血清疗效显著，深受病者和医务工作者的欢迎。以后又相继研制成抗五步蛇、抗银环蛇、抗眼镜蛇等抗血清。抗蛇毒血清的研制成功，为我国填补了空白，克服了中草药治疗蛇伤的疗效不佳的缺点，挽救了大量蛇伤病人的生命，取得了巨大的社会效益。园斑蝰蛇(Vipera russelli Venom)主要分布于我国广东、广西、福建。台湾等华南地区，是我国的主要毒蛇品种，国外东南亚分布较广，常见于马来西亚、越南、泰国、缅甸、 柬埔寨等国。园斑蝰蛇蛇毒属于血液毒，蝰蛇咬伤后患者发病迅速，死亡率高，可造成人体残疾。对野外从事林业、农业生产的工作者危害极大。近年来随着养蛇业的扩大，在饲养过程中发生蝰蛇咬伤的意外事故日益增多。蝰蛇的排毒量多、毒性强，一旦被咬伤，发病迅猛，病情凶险，死亡率高。所以对研制相应特效治疗血清显得极为迫切。国外已有抗蝰蛇毒血清产品上市，主要针对分布于欧洲的蝰蛇种类制备，已生产使用的蝰蛇毒血清有河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清等。英国药典1993年版第二卷记载的河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清的效价分别为抗河蝰(Vipera ammodytes Venom)抗血清每毫升中和效价不低于IOOLD5tl，抗毒蝰(Vipera aspis Venom)抗血清每毫升中和效价不低于IOOLD5tl，抗北极蝰 (Vipera berus Venom)抗血清每毫升中和效价不低于50LD5(1，抗草原蝰(Vipera ursinsi Venom)抗血清每毫升中和效价不低于150LD5。。国外现有的产品主要是基于欧洲分布的蝰蛇种类制备的，由于不同种类、不同地区的蝰蛇蛇毒抗原特异性具有种属差异和地域差异，国外蝰蛇抗血清用于治疗我国蝰蛇咬伤患者，针对性差，疗效不明显；另外蝰蛇排毒量多，毒性强，咬伤后发病迅速，死亡率高，需要高效价的抗血清才能中和。因此，本领域迫切需要高效价、针对国内分布的蝰蛇蛇毒的抗血清。甲醛常用来灭活病毒制造疫苗，或者用于毒素灭活生产类毒素，是一种经典的灭活方法。目前国内蛇毒灭活方法是甲醛灭活法，此法系将毒素和甲醛混合或对甲醛透析3-7天或更长时间进行脱毒，导致高度交联的蛇毒(Wright, G. G.，Duff, J. Τ.，Fiock，Μ. Α.， Devlin, H. B. , Soderstrom, R. L.,1960.Studies on immunity to toxins of Clostridium botulinum. V. Detoxification of purified type A and type B toxins, and the antigenicity of univalent and bivalent aluminium phosphate adsorbed toxoids. J. Immunol. 84，384)。这个脱毒反应比较复杂，涉及赖氨酸与吲哚、苯环、胍、ε -ΝΗ2、酰胺等基团交联形成亚甲基桥。这种交联桥的生成使得蛋白相互链接形成很大的复合物，同时， 这种反应是很难调控和重复，抗原的构象因此而发生改变，部分抗原表位被屏蔽(Visser J，Chapman DS. Snakes and snakebite. Cape Town, Struik，1978)。灭活毒素不像天然毒素，失去了部分能产生中和作用抗体的表位。表现为免疫后抗体的滴度很高，但是仅有很小一部分抗体具有中和蛇毒活性(WHO Guidelines for the Production, Control and Regulation of Snake Antivenom Immunoglobulins. 2008)。甲酸处理过的灭活蛇毒禾口抗蛇毒血清混合培育后，这些血清仍能中和蛇毒毒性，这从另外一个方面说明甲醛灭活抗原的构象发生了重大的变构。蛇毒有血液毒和神经毒等，神经毒素分子量小，毒性大，免疫原性差，既不容易脱毒又很难免疫获得高中和活性的抗体。同时，甲醛灭活是不完全的，有部分抗原的毒性位点未被消除，毒性没有完全被去除。甲醛灭活蛇毒免疫动物时反应很大，注射后常出现颤抖，发热，甚至出现神经和血液系统的症状，而导致死亡。用甲醛灭活的蛇毒免疫马等大型动物，需要大剂量抗原才能产生可用于治疗的抗毒素效价。这种方法使得动物不能耐受，也成为我们抗毒素生产中一个瓶颈。总之，甲醛灭活蛇毒仍保管蛇毒的部分毒性、蛇毒抗原构象改变、抗原性下降，导致动物免疫时不能耐受，获得的中和抗体效价低。需要研究一种温和的方法来灭活蛇毒，这种方法灭活的蛇毒蛋白其构象不发生明显变化，保留着天然蛇毒的关键性抗原表位，免疫后可以产生高效价中和抗体。同时高保真的蛇毒的应用，得以降低动物免疫用的抗原用量， 动物的副反应明显降低，体质获得提高，免疫系统的功能可以正常发挥，比较迅速地产生高滴度的中和抗体。因此，需要提供一种蛇毒灭活方法，使得蛇毒蛋白构象不发生明显变化，保留天然蛇毒的关键性抗原表位，从而灭活后的蛇毒免疫后可以产生高效价中和抗体，且降低免疫用的抗原用量，减少副反应，高滴度中和抗体产生迅速。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术的目的是提供一种蛇毒灭活方法及由此制得的灭活蛇毒，该蛇毒灭活方法设计新颖，可以使得蛇毒蛋白构象不发生明显变化，保留天然蛇毒的关键性抗原表位，从而灭活后的蛇毒免疫后可以产生高效价中和抗体，且降低免疫用的抗原用量，减少副反应，高滴度中和抗体产生迅速，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本专利技术的第一方面，提供了一种蛇毒灭活方法，其特点是， 采用蛋白烷基化试剂烷基化蛇毒，从而灭活所述蛇毒。所述烷基化可以在任何合适的条件下进行，较佳地，所述烷基化在可逆变性条件下进行。所谓“可逆变性条件”是指在烷基化时使蛇毒蛋白变性，在烷基化反应结束后使蛇毒蛋白复性的条件。更佳地，所述可逆变性条件通过蛋白变性剂和蛋白还原剂实现。所述蛋白变性剂可以是尿酸，所述蛋白还原剂可以是巯基乙醇。为了保证反应的充分进行，较佳地，所述烷基化是在20-40°C避光培育1-10小时完成。所述蛋白烷基化试剂是碘乙酰胺。通常蛋白烷基化试剂、蛋白变性剂和蛋白还原剂配制在一起形成溶液，例如配制碘乙酰胺溶液，溶液内含碘乙酰胺在100-200mM范围；溶液内含EDTA在0. 8-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种蛇毒灭活方法，其特征在于，采用蛋白烷基化试剂烷基化蛇毒，从而灭活所述蛇毒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙九如，范志和，柏伟，杨涛，李晓，王静，马祖严，
申请(专利权)人：上海赛伦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31