本发明专利技术提供了一种人源抗人表皮生长因子受体（EGFR）抗体及其编码基因与应用。本发明专利技术通过基因工程手段和噬菌体表面展示技术，从全合成单链人抗体库中筛选出抗人EGFR的基因工程单链抗体，并获得其抗体的可变区基因序列，在此基础上构建全人单克隆抗体，进一步获得高纯度抗体蛋白。本发明专利技术的抗体与人EGFR结合的亲和力不小于1nM，其突变体亲和力不小于10nM；并完成了抗体蛋白IgG的免疫活性和生物活性鉴定，证实抗体具有良好的抑制EGFR高表达细胞A431荷瘤模型小鼠肿瘤生长的生物学活性，本发明专利技术为针对EGFR靶标的抗肿瘤及其他疾病如炎症及自身免疫性疾病的预防和治疗提供了特异性抗体药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，主要是涉及特异性针对人表皮生长因子受体(epidemic growth factor receptor,EGFR)的抗体及其编码基因与应用。
技术介绍
表皮生长因子受体(EGFR)是表皮生长因子基因(erbB)家族的一员，在多种肿瘤如乳腺癌，结肠癌，头颈肿瘤，肾癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌的发展中均具有重要影响。国内外许多研究表明，针对EGFR的抗体可有效地在胞外通过阻断配体的结合来实现对EGFR信号转导途径的抑制，对多种由EGFR过度表达或/和突变所引起的人体肿瘤，尤其是头颈部鳞状细胞癌(80% 100%)、结直肠癌(25% 77%)、非小细胞型肺癌(40% 80%)等有较好的疗效。表皮生长因子受体是目前研究得较深入且倍受关注的肿瘤治疗靶点之一，应用基因工程手段研制抗EGFR的单克隆抗体，是目前肿瘤治疗的研究热点之一。目前已经有2株抗EGFR的治疗性抗体获得美国FDA的批准，分别是针对EGFR的鼠-人嵌合抗体西妥昔单抗(cetuximab,商品名为爱必妥)和全人抗体帕尼单抗(panitumumab),用于结直肠癌和头颈部肿瘤治疗。2005年,抗EGFR的人源化抗体尼莫珠单抗(nimotuzumab,商品名为泰欣生)获得了我国药监局(SFDA)批准的I类新药证书。针对该IE标的在研抗体包括人源化单抗pertuzumab、人源抗体zalutumumab和Necitumumab等。其结合的抗原表位不尽相同，但均能够发挥抑制EGFR介导的生物学功能。人抗体是治疗性抗体发展的最终方向，临床上应用人抗体可最大限度减少抗体的免疫原性、延长抗体在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fe段介导免疫调理、ADCC及CDC效应，进而增强抗体的生物学效应。人抗体的主要研制手段包括抗体库技术和转基因小鼠技术。目前，大容量抗体库技术已经非常成熟，尤其是噬菌体展示抗体库技术已经成功实现了多株全人抗体的成功上市。在已构建的大容量抗体库中，CAT公司的半合成抗体库和Marphosys AG公司的全合成抗体库是最具代表性和最为成功的代表。尤其是通过Marphosys AG公司的HuCAL GOLD技术已经获得了数十株具有开发价值的候选抗体，目前进入临床阶段的有17个项目。该技术的最大优势在于可以通过合理设计对抗体库进行优化，同时，其抗体框架基因为可替换的盒式结构，便于后期的抗体优化和改造，基于这一优势，HuCAL库目前已经将其抗体库更新至第三代，库容量达到4. 5X101(I，从抗体库中可筛选到亲和力达到PM水平的高亲和力抗体。因此，目前在技术上利用抗体库技术获得治疗性人抗体已经非常成熟，被认为是目前最成功的开发治疗性抗体的技术手段之一。申请人通过技术优化和探索，专利技术了一种高效的DNA连接和转化的方法，并将其用于大容量噬菌体抗体库的构建，构建了库容量达到1. 35 X IO10的大容量全合成噬菌体单链人抗体资源库(ZL. 200910091261. 8)，并利用该抗体库筛选获得了多个针对不同靶标的特异性抗体。本专利技术所获得的抗体Ame55即为从抗体库中筛选获得
技术实现思路
本专利技术提供了用于治疗和预防与EGFR表达相关的疾病，特别是表达EGFR的肿瘤和自身免疫性疾病的抗体治疗。本专利技术的第一个目的在于提供一种人源抗EGFR抗体及其活性片段的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的基因。本专利技术的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备治疗高表达/过度表达EGFR的恶性肿瘤和自身免疫性疾病药物中的应用。本专利技术运用噬菌体表面展示技术，从大容量全合成人源单链抗体库中，通过多轮的生物淘洗(bio-panning),筛选获得特异性抗人EGFR的单链基因工程抗体(singlechain variable fragment, scFv)。在本专利技术实施例中，将上述抗体轻重链可变区分别导入 全抗体哺乳动物细胞瞬时表达载体PABL和pABGl中，通过共转染HEK 293T细胞进行瞬时分泌表达，得到全抗体Ame55。本专利技术提供的抗体可变区氨基酸序列模式为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在此，FRl 4代表4个框架区域，⑶Rl 3代表3个高变区。FRl 4可以是从恒定区序列分离而来(比如人免疫球蛋白轻重链类、亚类或亚家族最常用的氨基酸)，也可以是从个人抗体框架区分离而来或从不同的框架区基因组合而来。例如Kabat等库中收录的众多人抗体框架区序列。其中，重链可变区为人免疫球蛋白亚群人重链VH V家族，轻链可变区为LambdaIII家族。关于轻重链的CDR区，通过丙氨酸扫描及其他同类氨基酸突变，获得大量突变体，对轻链CDR1、CDR2和CDR3的突变体评价结果表明CDRLl序列为SOTX1LGDKYX2X3 (SEQ IDNO I)在此，Xl可以是Ala、Gly、Asn、Lys，优选为Lys和Gly ；X2可以是Ala、Val和He，优选为 Ala ;X3 可为 Ser 和 Tyr，优选为 Ser。CDR2L 序列为EDX1KRPS(SEQ ID NO 2)，在此，Xl可以是 Ser、Thr、Ala 和 Gly，优选为 Ser。CDRL3 序列可以是X1X2WDX3DWX4MP (SEQ ID NO3),在此,Xl 为 Ser、Ala、Gly、Leu、Asn、Tyr 和 Gin,优选为 Ser ；X2 可以是 Val、Ser、Ala 和Leu,优选为Ser或Ala ；X3可以是Gly、Ala和Pro，优选为Gly ；X4可以是Gly和Ser，优选为Gly0对重链CDR2和CDR3的突变体评价结果表明CDRH2序列为X1IIYPX2DSDTRYSPSFQ (SEQID NO 5)，在此，Xl可以是Gly和Ser，优选为Gly ;X2可以是Gly和Ser，优选是Gly。CDR3H序列为 GIIYPSNVX1V (SEQ ID NO 6)，在此，Xl 可以是 Ala、Ser 和 Gly，优选为 Ser 或 Ala。对该抗体的轻重链⑶R区进行丙氨酸扫描，结果表明，轻重链⑶R3及轻链⑶Rl和重链⑶R2对抗体与EGFR的结合至关重要。仅单个氨基酸的变化可引起亲和力几倍至几十倍的改变，具体见实施例5。本专利技术提供的人源抗人EGFR抗体，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。进一步地，其轻链可变区含有如SEQ ID NO I和SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。更进一步地，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列。进一步地，本专利技术提供的人源抗人EGFR抗体，其重链可变区含有如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。进一步地，其重链可变区还含有如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。更进一步地，其重链可变区含有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。本专利技术提供的人源抗人EGFR抗体，其为单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白 IgGl、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4、IgD。本专利技术提供的人源抗人EGFR抗体Ame55，其重链可变区来自Vh5，其轻链可变区来自Va3，其抗体亚型为IgGl本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人源抗人EGFR抗体，其特征在于，其轻链可变区含有如SEQ?ID?NO?3所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙志伟，王双，孙久如，张畅，曾大地，仇玮祎，常红艳，范志和，杨涛，范铁炯，
申请(专利权)人：上海赛伦生物技术有限公司，中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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