可提高抗体滴度的免疫佐剂、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种可提高抗体滴度的免疫佐剂，每份免疫剂量的免疫佐剂含有0.4毫升羊毛脂、1.56毫升精制花生油和0.04毫升马GMCSF溶液，其中马GMCSF的含量为1微克至160微克。较佳地，马GMCSF的含量为10微克至80微克。还涉及上述的可提高抗体滴度的免疫佐剂的制备方法和在免疫马匹中的应用。本发明专利技术的可提高抗体滴度的免疫佐剂设计巧妙，应用方便，使用后可以较大幅度提高被免疫动物的抗体水平，具有很大的实用价值，适于大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫
，特别涉及免疫佐剂
，具体是指一种可提高抗体滴度的免疫佐剂、其制备方法及应用。
技术介绍
抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤时能用的唯一有特效的解毒药物。抗蛇毒血清通常是用大型家畜免疫相关的蛇毒，待蛇毒抗体达到一定滴度时采取血浆提取抗体成份制备而成。当这些抗蛇毒血清注射入蛇伤病人体内时，抗毒素可以很快中和相应的蛇毒。在蛇伤治疗中，马抗蛇毒血清发挥了无可替代的作用。马抗蛇毒血清是治疗蛇伤的最快速、最有效的药物。在我国每年有10万余人被毒蛇咬伤，临床上使用的抗蛇毒血清高达5万人份。但是蛇毒的毒性成份复杂，有血液毒、细胞毒、神经毒等。神经毒素的毒性相当强烈，有些神经毒素低至I微克即可毒死一只小鼠。神经毒素是小分子多肽，分子量在6000-8000道尔顿之间，抗原性非常弱，此类毒素免疫动物很难获得高滴度的抗血清。眼镜蛇毒就是这种类型的毒素,其毒性成分有10多种，主要的一种神经毒素的分子量为6949，毒力强(IMLD=0.0014mg/mouse),用常规的免疫方法很难获得高滴度的抗血清，以致经常无法满足社会的需求。为了获得高效价的抗眼镜蛇抗体，本专利申请人尝试了很多方法，如提高免疫的蛇毒剂量，增加超免次数和延长免疫时间，甚至采用日本田中氏的方法(Tanaka T.Studies on theimmunization of horses with snake venom.Zikken Igaku Zasshil941;25:159-77)。用未灭活的眼镜蛇毒从低剂量逐步提高到高剂量进行免疫长达半年等多种方法，也未能获得高滴度抗眼镜蛇毒中和抗体的目的。为此我们开展免疫佐剂的研究工作。免疫佐剂也称佐剂或抗原佐剂，是一类单独使用时一般无免疫原性，但是与抗原物质合并使用时能增强抗原物质免疫原性，增强机体免疫应答，或改变机体免疫应答反应类型的物质。免疫佐剂的生物作用包括:抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。细胞因子(cytokine)是一类机体在免疫反应时产生的免疫调节物质。机体的免疫系统在受到抗原和各种免疫佐剂的刺激后，产生的应答性物质，这类物质统称为细胞因子。天然的细胞因子为哺乳动物产生的蛋白质，多数为分子量较小的单体(1x104_2.5x104),也有天然状态为二体或三体的。免疫反应通常是由多种细胞因子参与调节的。细胞因子对抗原递呈细胞(APC)的作用有增加APC的数量和活化APC的功能两个方面。 细胞因子(Cytokine, CK)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称，细胞因子介导多种免疫细胞间的相互作用。天然的细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞分泌；且多以单体形式存在；以非特异性方式发挥作用。参与免疫应答与免疫调节，如IFN-Y刺激APC表达MHC-1I ;IL_1辅助T细胞活化；IL_2、4、5、6、GM-CSF等促进T、B细胞的增殖与分化。；TNF- a、IL-U IFN- Y等激活巨噬细胞，增强吞噬杀伤活性，TNF-aTNF-b具有细胞毒性并刺激中性粒细胞，IFN-Y抑制病毒复制。为了提高马匹免疫后机体免疫水平，以增强马的抵抗力，本专利技术人试用几种不同马细胞因子的佐剂，配合抗原免疫马匹。发现含有GMCSF的佐剂可以明显提高被免疫动物的抗体滴度。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种可提高抗体滴度的免疫佐剂、其制备方法及应用，该可提高抗体滴度的免疫佐剂设计巧妙，应用方便，使用后可以较大幅度提高被免疫动物的抗体水平，具有很大的实用价值，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本专利技术的第一方面，提供了一种可提高抗体滴度的免疫佐齐U，其特点是，所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂包括0.4毫升羊毛脂、1.56毫升精制花生油和0.04毫升马GMCSF溶液，其中所述马GMCSF的含量为I微克至160微克。较佳地，所述马GMCSF的含量为10微克至80微克。更佳地，所述马GMCSF的含量为20微克至40微克。所述马GMCSF溶液可以是重组马GMCSF溶液，例如可以根据中国专利技术专利申请CN201110090267.0所公开的方法制备，按此专利技术制备得到的重组马GMCSF溶液的浓度在0.01毫克/毫升和50毫 克/毫升之间，较佳地，所述的重组马GMCSF溶液的浓度在0.1毫克/晕升和10晕克/晕升之间。更佳地,重组马GMCSF溶液的浓度在I晕克/晕升和3晕克/晕升之间。 在本专利技术的第二方面，提供了一种上述的可提高抗体滴度的免疫佐剂的制备方法，其特点是，将0.4毫升羊毛脂、1.56毫升精制花生油和0.04毫升马GMCSF溶液经混匀而成乳状液体，其中所述马GMCSF的含量为I微克至160微克，所述乳状液体即为所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂。较佳地，所述马GMCSF的含量为10微克至80微克。更佳地，所述马GMCSF的含量为20微克至40微克。在本专利技术的第三方面，提供了上述的或上述的制备方法制备的可提高抗体滴度的免疫佐剂在免疫马匹中的应用。在本专利技术的第四方面，提供了一种上述的或上述的制备方法制备的可提高抗体滴度的免疫佐剂的使用方法，其特点是，将所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂和抗原混匀呈乳胶状后注射于马匹的颈部或臀部皮下，所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂的体积与所述抗原的体积的比在4:1和1:4之间。较佳地，所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂的体积与所述抗原的体积的比在2:1和I '2之间。更佳地，所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂的体积与所述抗原的体积的比为1:1o在本专利技术的第五方面，提供了一种免疫马匹的免疫方法，其特点是，至少在第一次免疫时使用上述的或上述的制备方法制备的可提高抗体滴度的免疫佐剂。较佳地，在每次免疫时均使用上述的或上述的制备方法制备的可提高抗体滴度的免疫佐剂。更佳地，每次免疫的间隔时间为10天。本专利技术的有益效果具体在于:本专利技术的可提高抗体滴度的每份免疫佐剂包括0.4毫升的羊毛脂、1.56毫升精制花生油和0.04毫升重组马GMCSF溶液，其中每份免疫佐剂所述马GMCSF的含量为I微克至160微克，用于免疫马匹时可以成倍提高动物的抗体滴度，从而使抗体的产品质量明显提高，表现在抗毒素产品时其中的抗毒素的比活性高，杂蛋白减少，相应的副作用也可以降低，因此，设计巧妙，应用方便，使用后可以较大幅度提高被免疫动物的抗体水平，具有很大的实用价值，适于大规模推广应用。附图说明图1是大肠杆菌重组表达和纯化后的马GMCSF在还原条件下的SDS-PAGE电泳结果，从左到右1-6泳道为纯化的马GMCSF，最右泳道是蛋白分子量标准。图2是不同量的马GMCSF佐剂对动物的免疫效果。不含GMCSF的佐剂免疫效果较差，随着佐剂中GMCSF含量的增加，动物的中和抗体滴度随之增加，在GMCSF含量为20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可提高抗体滴度的免疫佐剂，其特征在于，所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂含有0.4毫升羊毛脂、1.56毫升精制花生油和0.04毫升马GMCSF溶液，其中所述马GMCSF的含量为1微克至160微克。

【技术特征摘要】
1.一种可提高抗体滴度的免疫佐剂，其特征在于，所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂含有0.4毫升羊毛脂、1.56毫升精制花生油和0.04毫升马GMCSF溶液，其中所述马GMCSF的含量为I微克至160微克。2.根据权利要求1所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂，其特征在于，所述马GMCSF的含量为10微克至80微克。3.根据权利要求2所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂，其特征在于，所述马GMCSF的含量为20微克至40微克。4.一种根据权利要求1所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂的制备方法，其特征在于，将0.4毫升羊毛脂、1.56毫升精制花生油和0.04毫升马GMCSF溶液经混匀而成乳状液体，其中所述马GMCSF的含量为I微克至160微克，所述乳状液体即为所述的可提高抗体滴度的免疫佐剂。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述马GMCSF的含量为10微克至80微克。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述马GMCSF的含量为20微克至40微克。7.根据权利要求1至权利要求3任一所述的或根据权利要求4至权利要求6任一所述的制备方法制备的可提高抗体滴度的免疫佐剂在免疫马匹中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：柏伟，李晓，范铁炯，杨涛，孙九如，范志和，
申请(专利权)人：上海赛伦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：