针对人前列腺素E2 受体EP4 的抗体制造技术

本发明专利技术的目的在于提供与人PGE2受体亚型EP4结合来抑制EP4的功能的抗体或其功能片段。另外，目的在于提供包含该抗体或其功能片段的医药。使小鼠对人PGE2受体亚型EP4免疫，筛选出抑制EP4所致的细胞内cAMP上升的单克隆抗体。另外，对取得的单克隆抗体的CDR进行序列测定。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为201180046998.3、申请日为2011年9月28日、专利技术名称为“针对人前列腺素E2受体EP4的抗体”的专利技术申请的分案申请。
本专利技术涉及对人前列腺素E2受体亚型EP4的单克隆抗体。
技术介绍
前列腺素(PG)是与血栓素一起被称为前列腺素类的生理活性物质，是具有前列腺烷酸骨架的脂质。前列腺素等前列腺素类是利用磷脂酶A2由从膜磷脂质游离的花生四烯酸生物合成的。前列腺素根据附于其五元环的氧原子和双键的不同被区分为A～J各组。另外，根据前列腺烷酸骨架侧链的双键数，被区分为1～3组。例如，前列腺素E(PGE)中，存在有前列腺烷酸骨架侧链中存在的双键数不同的PGE1、PGE2、PGE3各组。对于PG，由利用环氧合酶I(COX-I)或环氧合酶II(COX-II)从花生四烯酸生物合成的PGG2而产生PGH2，其后，根据氧原子间键的断裂的不同，产生PGD2、PGE2、PGF2α等。进而，由PGE2产生PGA2、PGC2等。认为各PG的生成反应根据特异性酶的作用而产生，这些酶中存在组织特异性，产生与各组织的功能相适应的PG。PG中PGE具有各种重要的生物活性，认为介由其特异性的受体与血管扩张、血压下降、子宫收缩以及免疫系统的调节等相关。PGE2的受体与其它的PG受体同样地是7次膜贯通G蛋白质偶联受体。PGE2受体简称为EP，已知存在4种亚型(EP1、EP2、EP3、EP4)。各亚型在生物体内，EP1与细胞内Ca2+的上升相关，EP2和EP4与cAMP的上升相关，EP3与cAMP的减少相关(非专利文献1)。4种亚型在蛋白质构造上具有很高的相同性。报道了将对EP4选择性高的低分子化合物拮抗剂向诱导了实验性 自身免疫性脑脊髓炎或接触过敏症的小鼠给药时，所属淋巴节内的TH1和TH17细胞两者的蓄积减少，抑制了疾病的发展(非专利文献2)。示出了树状细胞中，PGE2由于EP4的活化所致的cAMP上升而使IL-23的产生亢进。另外，示出了在TH17细胞中，PGE2与IL-23协调地导致TH17细胞的增殖。示出了在TH17细胞中，EP4的活化所致的cAMP上升对细胞内信息传递发挥重要的作用(非专利文献3)。从这样的报告可知，PGE2受体、特别是EP4选择性拮抗剂对治疗因TH1或TH17涉及的免疫异常而导致的疾病有效果，该疾病例如有多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎症性肠病以及接触性皮肤炎等(非专利文献2)。报道了大多癌细胞与正常细胞相比，COX-II过量表达。进而显示PGE2对癌组织或周边组织起作用，与癌的发展有关。例如，示出了PGE2与难治性的炎症性乳腺癌细胞或肺癌细胞对转移组织的浸润相关(非专利文献4、5)。另外可知，PGE2介由EP4与非小细胞肺癌细胞、大肠癌细胞、炎症性乳腺癌细胞、B淋巴细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤的增殖相关。已知NK细胞具有直接攻击癌细胞的作用，但PGE2抑制该作用。作为PGE2抑制NK细胞活性的机制，显示有EP4的活化所致的细胞内的cAMP上升(非专利文献6)。另外，已知被认为抑制癌免疫的Treg细胞介由EP4而活化，有可能使生物体内对癌细胞的免疫机制降低(非专利文献7)。从这样的报告可知，PGE2对癌的发展很重要。因此，尝试了与PGE2的产生相关的COX的非选择性抑制剂的临床研究，但由于副作用无法得到充分的治疗成绩。PGE2受体、特别是EP4选择性拮抗剂能够直接抑制癌细胞的增殖，并且能够激活自身的癌免疫机制，所以期待与EP4受体选择性地结合的抗体对各种癌的治疗有效果，所述的癌例如有乳腺癌、大肠癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、B淋巴瘤。以往，非特异性的COX抑制剂用于减少疼痛。然而，已知非特异性的抑制剂会产生胃灼热、消化不良、恶心、腹胀、腹泻、胃痛、消化性溃疡、消化道出血之类的副作用。近年来，以疼痛治疗为目的开发了COX―II选择性抑制剂(例如塞来昔布、罗非昔布)。但是，COX―II选择性抑制剂在特定的患者中可能引发严重的心血管系统障碍，寻求利用不同的作用机制来减少疼痛的药剂。由COX产生的PG中，已知PGE2 会使痛觉的过敏性增强。特别是利用多个动物试验证明了PGE2受体中EP4与痛觉的过敏性的增强有关。例如已知对于大鼠脊髓后根神经节(DRG)而言，在炎症性疼痛模板中，EP4的表达增强，EP4的比较选择性拮抗剂(AH23848)可减少同模板中的疼痛的感受性(非专利文献8)。另外，在使用EP4基因敲除小鼠的解析中也得到相同的结果(非专利文献9)。从这样的报告可知，选择性地阻断EP4的功能的医药品对伴随免疫异常的疾病、癌、疼痛的治疗有效，并且副作用少。作为选择性地阻断EP4的功能的方法，报道了多个利用了低分子化合物的拮抗剂，但作为医药品还没有成功地开发。对于低分子化合物的拮抗剂，在对PGE2受体亚型(EP1～4)的结合选择性、对血栓素或其它的前列腺素类受体的结合亲和性的减少方面有改良的余地。如果没有充分的受体选择性则可能产生与COX抑制剂相同的副作用。期待与EP4受体选择性结合的抗体比低分子化合物受体选择性高。另外，抗体医药与低分子化合物相比，一般血中半衰期长，所以期待一次给药就长期保持药效，对慢性疾病(例如类风湿性关节炎、大肠炎、癌等)有用。抗体医药对膜蛋白质(受体)的主要作用机制通常是抗体识别表达该蛋白质的细胞后，基于补体依赖性细胞溶解作用(CDC)和抗体依赖性细胞媒介性细胞障碍作用(ADCC)而除去。然而，CDC、ADCC伴随着巨噬细胞等炎症细胞的活化，不能说一定适合因免疫异常引起的疾病、疼痛治疗。因此，将可选择性地抑制EP4的单克隆抗体应用于因免疫异常引起的疾病、疼痛治疗的情况下，优选不基于CDC、ADCC的功能性抗体。即，优选选择性地阻断EP4依赖的细胞内信息传递。目前，在专利第3118460号(专利文献1)中已有针对EP4的抗体的取得方法的记载，但还没有报告以低用量EP4特异性地抑制其功能的且不与EP1、EP2、EP3结合的具体的抗体。另外，专利第3118460号中记载的一般的单克隆抗体的取得方法中，已知通常难以取得针对7次膜贯通型受体的功能性抗体。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利第3118460号非专利文献非专利文献1:Sugimoto等，J.Biol.Chem.，282，11613-11617 2007非专利文献2:Yao等，Nat.Med.，15，633-640 2009非专利文献3:Sakata等，J Pharmacol Sci.,112(1):1？5.2010非专利文献4:Robertson FM Cancer.2010Jun 1；116(11Suppl):2806-14.非专利文献5:Martinet L.Biochem Pharmacol.2010Sep 15；80(6):838-45.非专利文献6:Sharma SD,Mol Cancer Ther.2010Mar；9(3):569-80.非专利文献7:Sharma S等Cancer Res.2005Jun 15；65(12):5211-20非专利文献8:Lin C.-R.等J Pharmacology and Experimental Therapeutics 2006 319:3(1096本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单克隆抗体或其功能片段，其对下述抗体或其功能片段与PGE2受体亚型EP4的结合进行竞争抑制，且其与PGE2受体亚型EP4的胞外域特异性结合，不与EP1、EP2、EP3结合，抑制使细胞内cAMP浓度上升的PGE2受体亚型EP4的功能，所述抗体或其功能片段与PGE2受体亚型EP4的胞外域特异性地结合，且不与EP1、EP2、EP3结合，抑制使细胞内cAMP浓度上升的PGE2受体亚型EP4的功能，其互补性决定区域1～3即CDR1～3的氨基酸序列满足下述(A)、(B)或(C)中的任一个，(A)：作为序列编号5表示的氨基酸序列的重链CDR1、作为序列编号6表示的氨基酸序列的重链CDR2、作为序列编号7表示的氨基酸序列的重链CDR3、作为序列编号8表示的氨基酸序列的轻链CDR1、作为序列编号9表示的氨基酸序列的轻链CDR2、和作为序列编号10表示的氨基酸序列的轻链CDR3，(B)：作为序列编号15表示的氨基酸序列的重链CDR1、作为序列编号16表示的氨基酸序列的重链CDR2、作为序列编号17表示的氨基酸序列的重链CDR3、作为序列编号18表示的氨基酸序列的轻链CDR1、作为序列编号19表示的氨基酸序列的轻链CDR2、和作为序列编号20表示的氨基酸序列的轻链CDR3，(C)：作为序列编号45表示的氨基酸序列的重链CDR1、作为序列编号46表示的氨基酸序列的重链CDR2、作为序列编号47表示的氨基酸序列的重链CDR3、作为序列编号48表示的氨基酸序列的轻链CDR1、作为序列编号49表示的氨基酸序列的轻链CDR2、和作为序列编号50表示的氨基酸序列的轻链CDR3。...

【技术特征摘要】
2010.09.29 JP 2010-2181581.一种单克隆抗体或其功能片段，其对下述抗体或其功能片段与PGE2受体亚型EP4的结合进行竞争抑制，且其与PGE2受体亚型EP4的胞外域特异性结合，不与EP1、EP2、EP3结合，抑制使细胞内cAMP浓度上升的PGE2受体亚型EP4的功能，所述抗体或其功能片段与PGE2受体亚型EP4的胞外域特异性地结合，且不与EP1、EP2、EP3结合，抑制使细胞内cAMP浓度上升的PGE2受体亚型EP4的功能，其互补性决定区域1～3即CDR1～3的氨基酸序列满足下述(A)、(B)或(C)中的任一个，(A)：作为序列编号5表示的氨基酸序列的重链CDR1、作为序列编号6表示的氨基酸序列的重链CDR2、作为序列编号7表示的氨基酸序列的重链CDR3、作为序列编号8表示的氨基酸序列的轻链CDR1、作为序列编号9表示的氨基酸序列的轻链CDR2、和作为序列编号10表示的氨基酸序列的轻链CDR3，(B)：作为序列编号15表示的氨基酸序列的重链CDR1、作为序列编号16表示的氨基酸序列的重链CDR2、作为序列编号17表示的氨基酸序列的重链CDR3、作为序列编号18表示的氨基酸序列的轻链CDR1、作为序列编号19表示的氨基酸序列的轻链CDR2、和作为序列编号20表示的氨基酸序列的轻链CDR3，(C)：作为序列编号45表示的氨基酸序列的重链CDR1、作为序列编号46表示的氨基酸序列的重链CDR2、作为序列编号47表示的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：高山喜好，清水朋子，漆畑祐司，杉本幸彦，
申请(专利权)人：株式会社NB健康研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP