细胞的筛选方法、核酸的制造方法、重组细胞的制造方法、目标物质的制造方法、药物组合物的制造方法及试剂技术

本发明专利技术提供一种能够更迅速且高效地筛选生产与期望的细胞膜蛋白质进行特异性结合的目标物质的目标细胞的技术，其包含以下内容：提供具有多个微孔2的基板1。使在细胞表面表达靶标细胞膜蛋白质的第一细胞3附着于各微孔2中。向各个微孔2中，导入1或2个作为目标细胞的候补第二细胞5，使其在微孔2内与第一细胞3共存，使第二细胞5分泌的目标物质6与第一细胞3接触。选定包含结合有目标物质6的第一细胞3的微孔2。从选定的微孔2中，回收作为目标细胞的第二细胞5。作为目标物质6可以举出抗体。也可以加入标记物质7进行可视化。以加入标记物质7进行可视化。以加入标记物质7进行可视化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞的筛选方法、核酸的制造方法、重组细胞的制造方法、目标物质的制造方法、药物组合物的制造方法及试剂


[0001]本专利技术涉及细胞的筛选方法、核酸的制造方法、重组细胞的制造方法、目标物质的制造方法、药物组合物的制造方法及试剂。

技术介绍

[0002]周所周知，G蛋白偶联受体(GPCR)、转运蛋白、离子通道、细胞因子受体等的细胞膜蛋白质与各种疾病有关，它们正作为诊断药物、医疗用医药品的靶标分子而受到关注。细胞膜蛋白质是细胞外的物质，例如，通过与包含低分子化合物、肽、蛋白质等配体结合，其功能被活性化或抑制，由此而发挥细胞功能或药理功能。
[0003]此外，近年，与细胞膜蛋白质结合的特异抗体或抗体样分子(抗体片断、单链抗体、双特异性抗体或药剂结合抗体等)正在受到关注，将其用作诊断药或医疗用医药品的开发也正在开展。
[0004]在细胞膜蛋白质中，特别是针对多次跨膜蛋白质(例如，GPCR、转运蛋白、离子通道等)的特异性结合物质(例如，蛋白质配体、肽配体、特异抗体等)正在作为医药品而被开发。但是，已作为医药品而实用化的物质还很有限。
[0005]多次跨膜蛋白质与可溶性蛋白质(例如，细胞因子、激素、酶、核内受体)相比，包含很多的疏水性结构，因此分离纯化非常困难。此外，能够被证明保持有在自然界中存在的结构，并且保持多次跨膜蛋白质的功能的纯化例非常有限。一般而言，多次跨膜蛋白质以存在于细胞的脂质双分子膜中的状态而发挥其功能性。
[0006]作为探索针对细胞膜蛋白质的特异性结合物质的技术，例如，可以举出大量制造并纯化作为细胞膜蛋白质的一部分而暴露在细胞外的可溶性结构域或部分肽，并对其进行使用的方法。例如，可以举出将纯化的所述可溶性结构域或部分肽固相化在96孔板上，以ELISA法等评价其与作为候补的特异性结合物质的结合性的方法。然而，就以这样的方法筛选物质而言，无法保证其能够以特异且高的亲和性与存在于活体内的靶标细胞膜蛋白质相结合。因此，在以诊断药或医疗用医药品的开发为目的而探索细胞膜蛋白质的有效特异性结合物质时，为了模拟活体内的细胞膜蛋白质的立体结构，使用在活细胞的细胞膜上表达有靶标细胞膜蛋白质的哺乳动物细胞是更为有效的。
[0007]另一方面，就肽配体、蛋白质配体、特异抗体等物质而言，可以通过培养来源于人类或非人类动物的细胞、应用了基因重组技术的重组细胞，而使它们分泌这些物质到培养上清中。此处，如果发现与靶标细胞膜蛋白质特异性结合的未知物质，则需要以生产不同的物质的数千～数万种的生产细胞集团(例如，抗体生产杂交瘤库)作为调查对象。但是近年来，为了探索新物质而需要调查的生产细胞数有不断增加的倾向，需要调查数万～数千万种的细胞。因此，在生产细胞的培养、维持所花费的成本、探索所花费的时间等方面，现有技术存在巨大的技术问题。
[0008]作为探索针对期望的细胞膜蛋白质的特异性抗体的现有技术，可以举出将杂交瘤
培养和流式细胞仪组合手法。例如，制备数千种的杂交瘤的培养上清，使其与在细胞表面表达有靶标细胞膜蛋白质的CHO细胞接触，并且使用流式细胞仪评价结合性。然后，将判定为阳性的杂交瘤回收，以极限稀释法进行进一步的培养。然后，重复使用了流式细胞仪的结合性评价，花费2个月左右，能够鉴定出产生期望的特异性抗体的细胞(例如，专利文献1)。
[0009]但是，众所周知，对非人类动物以GPCR等的细胞膜蛋白质作为抗原进行免疫时，亲和性、特异性这两者均较高的抗体的出现频度极低。要筛选产生这样的出现频度低的特异抗体的目标细胞，以杂交瘤法，需要对数十万～数百万种的生产细胞进行培养和评价。因此，可以认为利用杂交瘤培养和流式细胞仪的现有方法已经接近了其能力的极限。
[0010]作为其他的技术，应用了单细胞解析技术的特异性抗体生产细胞的鉴定法正在被开发(非专利文献1)。例如，将1个抗体生产细胞和抗原蛋白质封入疏水性的微流控液滴中。然后，能够将从抗体生产细胞中分泌的抗体和抗原蛋白质的结合的有无可视化，并在具有微流路的分析机器中分离出包含产生特异性抗体的阳性细胞的微流控液滴。
[0011]在非专利文献2中，则记载有应用了微流控液滴和微流路的特异性抗体生产细胞的鉴定方法的原理。
[0012]然而，就该方法而言，存在以下的缺点：在将微流控液滴中的抗体和抗原蛋白质的结合的有无可视化的过程中，无法增加清洗步骤。因此，在以细胞膜表面上表达量极少的细胞膜蛋白质为靶标时，与背景的荧光信号相比，抗体和抗原蛋白质的结合所发出的荧光信号较弱，故难以确认是否存在所述结合(非专利文献1)。
[0013]另外，微流控液滴中的细胞的生存维持，特别是，来源于未进行不死化的骨髓组织、脾脏、淋巴组织、血液细胞的B淋巴球、浆细胞的生存维持非常困难，需要根据细胞种类而进行严密的控制。
[0014]此外，一般而言，在包含阳性细胞的微流控液滴中也包含多种阴性抗体生产细胞。因此，为了建立单克隆抗体，还需要实施多次的筛选操作。
[0015]此外，就用于使抗体和靶标细胞膜蛋白质的结合的有无可视化的方法而言，需要根据靶标细胞膜蛋白质进行优化，要进行通用的实用化还存有改良的余地。
[0016]在专利文献2中记载有：使表达靶标细胞膜蛋白质的细胞集团在载玻片上与候补的细胞集团接触，从候补的细胞集团中鉴定出产生针对靶标细胞膜蛋白质的抗体细胞的技术。但是，由于该方法也同样无法进行所述的清洗步骤，以在细胞膜表面上表达的量极少的细胞膜蛋白质为靶标时，难以确认抗体和细胞膜蛋白质是否结合。
[0017]在专利文献3中，公开了：向涂覆有纯化的可溶性细胞因子受体蛋白质的微孔中导入抗体生产细胞的候补，以细胞分泌的抗体和可溶性细胞因子受体蛋白质的结合性来筛选期望的抗体生产细胞的技术。但是如上所述，分离纯化的受体蛋白质不一定保持有能够在活体内发挥功能的结构。并且，要将难以纯化的多次跨膜蛋白质适用于该方法是非常困难的。
[0018]现有技术文献
[0019]专利文献
[0020]专利文献1：国际公开第2012/043634号
[0021]专利文献2：国际公开第2004/051268号
[0022]专利文献3：日本专利第4148367号公报
[0023]非专利文献
[0024]非专利文献1:Fitzgerald V,Leonard P.,"Single cell screening approac hes for antibody discovery",Methods,116:34
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42,2017
[0025]非专利文献2:Shembekar et al.,"Single
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Cell Droplet Microfluidic Scre ening for Antibodies Specifically Binding to Target Cells",Cell Reports 22,2206
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2215,February 20,2018...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种细胞的筛选方法，其是从第二细胞的集团中筛选目标细胞的细胞筛选方法，所述目标细胞生产与期望的细胞膜蛋白质特异性结合的目标物质，该方法包括下述步骤：a)提供具有多个微孔的基板的步骤，b)使细胞表面上表达所述细胞膜蛋白质的第一细胞附着于各个所述微孔的步骤，c)在步骤b)之后，向各个所述微孔中，导入从所述集团中分离出的1或2个第二细胞，在所述微孔内使所述第一细胞和所述第二细胞共存的步骤，d)在步骤c)之后，选定包含有结合有所述目标物质的第一细胞的微孔的步骤，e)从步骤d)选定的微孔中，回收作为所述目标细胞的所述第二细胞的步骤。2.如权利要求1所述的细胞的筛选方法，其中，所述步骤d)包含将所述目标物质与所述第一细胞的结合进行可视化的可视化步骤。3.如权利要求2所述的细胞的筛选方法，其中，所述可视化步骤包含向所述微孔中添加待与所述目标物质特异性结合的标记物质的步骤。4.如权利要求3所述的细胞的筛选方法，其中，所述标记物质为针对所述目标物质的标记抗体。5.如权利要求3或4所述的细胞的筛选方法，其中，所述标记物质中的标记为荧光标记。6.如权利要求5所述的细胞的筛选方法，其中，所述标记物质是以第一荧光物质进行了标记的抗体，所述步骤b)包含以第二荧光物质标记附着于所述微孔中的所述第一细胞的第一细胞标记步骤，第一荧光物质发出的荧光的荧光波长与第二荧光物质发出的荧光的荧光波长不同。7.如权利要求2所述的细胞的筛选方法，其中，所述可视化步骤包含：将所述目标物质与所述第一细胞结合时所发生的，伴随所述细胞膜蛋白质的活性化的细胞内信息传递物质的变动进行可视化的步骤。8.如权利要求1～7中的任一项所述的细胞的筛选方法，其中，所述细胞膜蛋白质为多次跨膜蛋白质。9.如权利要求1～8中的任一项所述的细胞的筛选方法，其中，所述第一细胞为导入了表达所述细胞膜蛋白质的载体的细胞。10.如权利要求1～8中的任一项所述的细胞的筛选方法，其中，所述第一细胞为表达所述细胞膜蛋白质的肿瘤细胞。11.如权利要求1～8中的任一项所述的细胞的筛选方法，其中，所述第一细胞为表达所述细胞膜蛋白质的非肿瘤细胞。12.如权利要求1～11中的任一项所述的细胞的筛选方法，其中，所述目标物质为抗体。13.如权利要求12所述的细胞的筛选方法，其中，所述第二细胞来源于以所述细胞膜蛋白质或编码它的核酸进行了免疫并来源于非人...

【专利技术属性】
技术研发人员：芦田仁己，漆畑祐司，高山喜好，
申请(专利权)人：株式会社NB健康研究所，
类型：发明
国别省市：