与C-Met相关的生物物质制造技术

本发明专利技术涉及可能与VEGF和/或EGFR组合地与c‑Met相关的生物物质，并且更特别地涉及多肽、编码所述多肽的核酸；涉及用于制备所述多肽的方法；涉及表达或能够表达所述多肽的宿主细胞；涉及包含所述多肽的组合物，特别是药物组合物，其用于预防、治疗或诊断目的。本发明专利技术还描述并提供了用于评估患者对c‑Met治疗的响应性的方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2012年10月1日、专利技术名称为“与C-Met相关的生物物质”的中国专利申请No.201280047858.2的分案申请。专利
本专利技术涉及与c-Met相关的生物物质，并且更特别地涉及多肽、编码所述多肽的核酸；涉及用于制备所述多肽的方法；涉及表达或能够表达所述多肽的宿主细胞；涉及包含所述多肽的组合物，特别是药物组合物，其用于预防、治疗或诊断目的。本专利技术还描述并提供了用于评估患者对c-Met治疗的响应性的方法和试剂盒。专利技术背景受体酪氨酸激酶(RTKs)是重要细胞过程(诸如细胞生长、分化、新血管生成和组织修复)的关键调控剂。除了其在正常生理学中的重要性之外，某些RTKs的异常表达已经参与多种类型的癌症的形成和进展。这些RTKs已经成为用于癌症治疗的有希望的药物靶标。RTK c-Met是针对肝细胞生长因子((HGF)，也称为分散因子)的细胞表面受体(Cooper等，Nature(自然)1984；311:29-33；Bottaro等，Science(科学)1991；251:802–4)。HGF是90kD的多结构域糖蛋白，其与纤维蛋白酶原丝氨酸蛋白酶家族的各成员高度相关。其由间充质细胞分泌为单链的无活性的多肽，并且由多种蛋白酶裂解为其活性的α/β异源二聚体细胞外形式(Birchmeier等，Nat Rev Mol Cell Biol(自然分子细胞生物学综述)2003；4:915–25)。α链NH2-末端部分包含高亲和力c-Met受体结合结构域，但是β链是与c-Met受体相互作用用于受体激活所必需的(Matsumoto&Nakamura Cancer Sci(Matsumoto&Nakamura癌症科学)2003；94:321–7)。c-Met受体，与其配体相似，是由细胞外α和β链组成的二硫键连接的异源二聚体。α链异源二聚体化到β链的氨基端部分，形成细胞外结构域中的主要配体结合位点。c-Met的羧基端尾部包含酪氨酸Y1349和Y1356，其在被磷酸化时作为细胞内衔接蛋白(intracellular adaptor proteins)的停靠位点，引起下游信号传导(Ponzetto等，Mol Cell Biol(分子细胞生物学)1993；13:4600–8)。c-Met/HGF途径是侵袭性生长程序(invasive growth program)的主要驱动者，所述侵袭性生长程序是一系列的事件，包括细胞增殖、分散、迁移、存活和组织侵袭。在正常情况下，侵袭性生长程序对于胚胎发生过程中的正确的器官形成和成年人内稳态是重要的。重要的是，其还参与肿瘤发生、肿瘤血管形成和转移。使用防止配体/受体结合的HGF-或c-Met-特异性抗体，通过抑制增殖并且增强细胞凋亡而导致生长抑制和肿瘤消退。三种单克隆抗体的组合在体外和体内表现出针对HGF的高中和活性，并且表现出针对自分泌HGF-Met-表达性神经胶质瘤异种移植物肿瘤的显著的肿瘤生长抑制(Cao等，Proc Natl Acad Sci U S A(美国国家科学院学报)2001；98:7443–8)。使用单克隆抗体的策略允许针对HGF/c-Met的排他性的特异性，与小分子激酶抑制剂相比相对长的半衰期，以及激发针对肿瘤细胞的宿主免疫应答的潜力(Liu等，Expert Opin Investig Drugs(药物研究的专家观点)2008；17:997–1011)。AMG102(Amgen,Inc.)是完全的人IgG2单克隆抗体，其选择性结合并且中和HGF，由此防止其与c-Met结合以及随后的活化(Kakkar等，Pharm Res(药物研究)2007；24:1910–8；Burgess等，Cancer Res(癌症研究)2006；66:1721–9)。单臂5D5(OA5D5,MetMAb；Genentech)是来源于激动性单克隆抗体5D5的人源化的、单价的、拮抗性抗-c-Met抗体(Nguyen等，Cancer Gene Ther(癌症基因治疗)2003；10:840–9)。MetMAb以高亲和力结合c-Met，并且保持在具有c-Met的细胞表面上，防止HGF结合和随后的c-Met磷酸化以及下游信号传导活动和细胞反应。不幸的是，使用大的单克隆和/或极大改造的抗体还带有高的制备成本，并且与其他策略相比，导致不是最理想的肿瘤透过性。根据目前的生物医学理解，耐药性由负责调节细胞增殖、凋亡、迁移和侵入的复杂的蛋白网络引起。目前，还没有关于生长因子受体依赖性信号传导途径的系统性描述。事实上，c-Met异常性推动癌症发展的分子途径是极端复杂的，并且涉及多种相互连接的信号传导途径，包括信号传导分子(如Ras和PI3K)、受体(如EGFR)和生长因子(如VEGF)。已经描述了靶向血清白蛋白来延长生物分子(诸如例如免疫球蛋白单可变结构域)的半衰期，例如，在WO2008/028977，WO04/041865和WO08/122787中，和未公布的2011年6月23日提交的US 61/500,464。专利技术概述本领域需要更有效的c-Met(或者本文中还称为c-MET)拮抗剂，与小分子药物相比，其具有优越的选择性和特异性，调节半衰期的能力，和/或优越的肿瘤靶向性，即，比常规抗体小，并且具有基于白蛋白的肿瘤靶向策略。此外，本领域还需要诊断、预防和/或治疗适用的c-Met拮抗剂，如本文所提供的。在研究和治疗应用中，免疫球蛋白序列，如抗体和来源于其的抗原结合片段(例如，免疫球蛋白单可变结构域)用于特异性靶向其各自的抗原。免疫球蛋白单可变结构域诸如例如VHHs的产生可能包括免疫实验动物，如美洲驼(Llama)，从免疫组织构建噬菌体文库，选择结合噬菌体展示的抗原的免疫球蛋白单可变结构域并针对需要的特异性筛选所述结构域及其改造的构建体(WO 94/04678)。备选地，通过直接从首次用于实验的文库或合成的文库中选择结合噬菌体展示的抗原的免疫球蛋白单可变结构域，并且随后针对需要的特异性筛选所述结构域及其改造的构建体可以产生相似的免疫球蛋白单可变结构域，诸如例如，dAbs(Ward等，Nature(自然)，1989,341:544-6；Holt等,Trends Biotechnol.(生物技术趋势),2003,21(11):484-490；以及例如，WO 06/030220,WO 06/003388和Domantis Ltd.的其他公布的专利申请)。本专利技术涉及特定的多肽，其也称为“本专利技术的多肽”或“本专利技术的免疫球蛋白单可变结构域”或“本专利技术的ISVD”，所述多肽包含下述，或者，更优选地，基本上由下述组成：(i)基本上由一个或多个(优选一个)免疫球蛋白单可变结构域组成的第一结构单元，其中所述免疫球蛋白单可变结构域针对c-Met，特别是针对人c-Met；(ii)任选地基本上由一个或多个(优选一个)免疫球蛋白单可变结构域组成的第二结构单元，其中所述免疫球蛋白单可变结构域针对血清白蛋白，特别是针对人血清白蛋白(并且甚至更优选地，其中所述免疫球蛋白单可变结构域是Alb11或Alb23(如本文定义))；(iii)任选地基本上由一个或多个(优选一个)免疫球蛋白单可变结构域本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够将HGF从人c‑Met(SEQ ID NO:1)上置换下来的免疫球蛋白单可变结构域，其IC50小于10nM，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含具有式1的氨基酸序列：FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4(1)；其中FR1‑FR4是指构架区1‑4，并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且其中CDR1选自由以下组成的组：a)SEQ ID NO:160；b)与SEQ ID NO:160具有至少80％的氨基酸同一性的多肽；c)与SEQ ID NO:160具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；并且其中CDR2选自由以下组成的组：d)SEQ ID NO:170，e)与SEQ ID NO:170具有至少80％的氨基酸同一性的多肽，f)与SEQ ID NO:170具有3、2或1个氨基酸差异的多肽，并且其中CDR3选自由以下组成的组：g)SEQ ID NO:180，h)与SEQ ID NO:180的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一个具有至少80％的氨基酸同一性的多肽，i)与SEQ ID NO:180具有3、2或1个氨基酸差异的多肽。

【技术特征摘要】
2011.09.30 US 61/541,368;2012.03.30 US 13/435,5671.能够将HGF从人c-Met(SEQ ID NO:1)上置换下来的免疫球蛋白单可变结构域，其IC50小于10nM，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含具有式1的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；其中FR1-FR4是指构架区1-4，并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；并且其中CDR1选自由以下组成的组：a)SEQ ID NO:160；b)与SEQ ID NO:160具有至少80％的氨基酸同一性的多肽；c)与SEQ ID NO:160具有3、2或1个氨基酸差异的多肽；并且其中CDR2选自由以下组成的组：d)SEQ ID NO:170，e)与SEQ ID NO:170具有至少80％的氨基酸同一性的多肽，f)与SEQ ID NO:170具有3、2或1个氨基酸差异的多肽，并且其中CDR3选自由以下组成的组：g)SEQ ID NO:180，h)与SEQ ID NO:180的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一个具有至少80％的氨基酸同一性的多肽，i)与SEQ ID NO:180具有3、2或1个氨基酸差异的多肽。2.权利要求1的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述构架区(FRs)与SEQ ID NO:102的FRs具有大于80％的序列同一性。3.权利要求1的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域包含具有式1的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；其中FR1-FR4是指构架区1-4，并且是免疫球蛋白单可变结构域的构架区；其中CDR1是SEQ ID NO:160，其中CDR2是SEQ ID NO:170；并且其中CDR3是SEQ ID NO:180。4.包含权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。5.权利要求4的多肽，其中所述多肽选自由以下组成的组：氨基酸序列与SEQ ID NO:187具有大于80％的序列同一性的多肽。6.权利要求4-5中任一项的多肽，其另外包含与人血清白蛋白结合的免疫球蛋白单可变结构域，诸如例如Alb11(SEQ ID NO:5)或Alb23(SEQ ID NO:101)。7.权利要求4-6中任一项的多肽，其中所述多肽选自由以下组成的组：氨基酸序列与SEQ ID NO:142-150具有大于80％的序列同一性的多肽。8.权利要求4-7中任一项的多肽，其中所述多肽选自由以下组成的组：氨基酸序列与SEQ ID NO:143,146或147具有大于80％的序列同一性的多肽。9.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白单可变结构域或权利要求4-8中任一项的多肽，其中在α筛选测定中的IC50为1.2nM以下。10.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白单可变结构域或权利要求4-9中任一项的多肽，其中在α筛选测定中的IC50为500pM以下。11.核酸序列，所述核酸序列编码：i)权利要求1-3，9或10...

【专利技术属性】
技术研发人员：格拉尔德·贝斯特，盖伊·赫尔曼斯，索伦·斯特芬森，亚历山大·希罗基，塞德里克·约瑟夫·内奥特里·韦尔韦肯，延纳克·德纳耶尔，
申请(专利权)人：埃博灵克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE