一种基于NK3受体的合成肽NK3R-A2及其应用制造技术

本发明专利技术属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤血管生成作用的基于NK3受体的合成肽NK3R‑A2。该合成肽分子量为：1536.70Da，具体序列为：CNGRCGGDFF(MeF)GLM‑NH2；该合成肽采用Fmoc固相多肽合成法制备而成；可用于制备抗肿瘤制剂。通过体外细胞活性实验、细胞划痕实验以及细胞迁移实验验证了它的抗血管生成作用，同时通过对其进一步的鸡胚尿囊膜载体实验以及具有丰富血管的小鼠S180移植瘤模型实验验证，发现其对肿瘤的抑制效果明显，具有抗肿瘤血管生成作用，且无明显的毒副作用，具有较好的医疗应用前景，同时也为肿瘤治疗提供了十分具有潜力的靶向序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤治疗
，具体涉及一种具有抗肿瘤血管生成作用的基于NK3受体的合成肽NK3R-A2。
技术介绍
近年来，随着全球经济的飞速发展，临床诊断、手术治疗、化疗和放疗等水平也不断提高，但是传统的肿瘤治疗手段依旧不能缓解随着环境日益严重而给人类带来的健康威胁，尤其是近几十年来癌症患者的数目直线增长，人们急需新的、有效的肿瘤治疗策略和手段。自70年代，Folkman发现肿瘤血管形成因子（TAF）以来，人们对于血管生成有了新的认识，尤其是近10年来，人们就血管生成与肿瘤的发生发展之间的关系进行了大量的研究，发现肿瘤是血管依赖型的恶性细胞，其生长、转移、复发和预防均与肿瘤血管生成密切相关，而抗肿瘤血管生成策略也成为了肿瘤治疗中的研究热点。与传统的治疗方法相比，抗肿瘤血管生成的治疗方法更注重全方面的治疗肿瘤，它通过改变肿瘤微环境，来防止肿瘤的复发和转移。既降低了放/化疗药物的大规模细胞毒性作用，减少损伤正常细胞，又提高了药物的靶向治疗效果，目前普遍认为，抗肿瘤血管生成治疗具有高效、迅速、副作用少、一般不会产生抗药性等优点。血管生成过程依赖于各个生长因子和信号通路的分泌与调控，因此，针对促血管生成因子的拮抗物质，无论是从多肽药物还是单抗药物都成为了抗肿瘤血管生成的重要研究方向，例如针对血管内皮生长因子（VEGF）的单克隆抗体，其抗肿瘤活性作用已经得到了美国食品药品监督管理局（FDA）的认证。而近几年来的研究发现，神经激肽B（NKB）能够可逆的抑制血管内皮细胞血管网络的形成，它通过与其速激肽家族主要结合受体NK3的结合可以介导消除Ca2+振荡，并且增加3’-5’环化腺苷酸（cAMP）的含量从而来减少细胞的增殖、迁移以及血管内皮细胞生长因子受体的表达，并诱导抗血管生成蛋白钙网蛋白的产生。目前对于NKB及其受体NK3的生物调节机理尽管已有了较多的基础研究，但是仍然处于初步探索阶段，而对于其在抗肿瘤血管生成方面的应用研究尚需进一步地进行深入的探讨研究。
技术实现思路
本专利技术基于NK3受体及现有NKB结构研究基础上，提出设计了一种新的合成肽NK3R-A2，该合成肽由甘氨酸柔性连接子将改造后与NK3受体有更高亲和性且具有抗血管生成作用的多肽片段和具有靶向肿瘤血管的氨基肽酶N配体基序连接起来构成。本专利技术所采取的技术方案如下所述。一种基于NK3受体合成肽NK3R-A2，该合成肽由两个功能结构域通过甘氨酸柔性连接子连接构建而成，具体为由甘氨酸柔性连接子将与NK3受体结合的多肽片段和具有靶向肿瘤血管的氨基肽酶N配体基序连接起来构成；：该合成肽分子量为：1536.70 Da，序列如SEQ ID NO.1所示，具体序列为： Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2；即：CNGRCGGDFF(MeF)GLM-NH2或CNGRC-GG-DFF(MeF)GLM-NH2。所述基于NK3受体合成肽NK3R-A2，采用Fmoc固相多肽合成法制备而成；具体过程为：（1）选用Rink树脂与待合成肽C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基以共价键形式连接，再以该氨基酸的N端作为该条多肽合成的起点，并让其与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应，形成肽键；（2）然后，将N端的Fmoc-氨基酸的保护基进行脱保护，再让第二个氨基酸的N端与后面的氨基酸的羧基反应，如此不断重复这一过程直至多肽合成完毕；（3）最后再将合成的多肽从树脂上切割下来，经过乙醚沉淀与洗涤，得到此粗肽；（4）经过脱盐处理，RP-HPLC分析纯化，得到本专利技术所述的基于NK3受体的具有抗血管生成作用的合成肽NK3R-A2，所得合成肽NK3R-A2亦可进一步置于-20℃冻存备用。所述基于NK3受体的合成肽NK3R-A2，用于抗肿瘤血管生成。本专利技术基于现有NK3受体即NKB研究基础上，对现有的NKB多肽序列（Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2）重新进行了设计，通过将其缬氨酸（Val）替换为甲基苯丙氨酸（MePhe），设计了一种新的改造肽，提高了其与NK3受体的亲和性。为进一步加强NKB的抗血管生成作用，降低其细胞毒性作用，专利技术人又整合进氨基肽酶N配体的可耦联药物并起定位肿瘤血管作用的一段多肽序列（Cys-Asn-Gly-Arg-Cys），通过甘氨酸柔性连接子将两段序列连接后，可较好的保证新的合成肽序列具有一定的自由度，防止发生潜在的空间位阻问题而影响其与相应受体结合而发挥作用。通过对合成肽NK3R-A2进行体外细胞活性实验、细胞划痕实验以及细胞迁移实验验证了它的抗血管生成作用，同时通过对其进一步的鸡胚尿囊膜载体实验以及具有丰富血管的小鼠S180移植瘤模型实验验证，发现其对肿瘤的抑制效果明显，具有抗肿瘤血管生成作用，且无明显的毒副作用，具有较好的医疗应用前景，同时也为肿瘤治疗提供了十分具有潜力的靶向序列。本专利技术所提供的、新的合成肽序列（NK3R-A2），具有较好的抗肿瘤血管生成作用，表现出了较好的潜在应用价值。附图说明图1为NK3R-A2的ESI-MS质谱分析鉴定结果；图2为NK3R-A2在25μM时，对于HUVECs增殖的影响；图3为NK3R-A2在25μM时，在细胞划痕实验中对于HUVECs迁移的影响；图4为NK3受体选择性拮抗剂[Gly6]NKB[3-10]在细胞划痕实验中拮抗NK3R-A2抑制作用的情况；图5为NK3R-A2在细胞迁移实验中对于HUVECs迁移的影响；图6为NK3受体选择性拮抗剂[Gly6]NKB[3-10]在细胞迁移实验中拮抗NK3R-A2抑制作用的情况；图7为NK3R-A2在鸡胚尿囊膜实验中的相关结果，其中（a）相对血管密度情况，（b）为相对血管面积情况；图8为鸡胚尿囊膜（CAM）载体实验情况，其中（a）为受体选择性拮抗剂[Gly6]NKB[3-10] 拮抗NK3R-A2时血管密度对比情况，（b）为受体选择性拮抗剂[Gly6]NKB[3-10] 拮抗NK3R-A2时血管面积对比情况；图9 为NK3R-A2对荷S180的BABL/c小鼠体重变化的影响结果图；图10 为NK3R-A2对荷S180的BABL/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；图11为NK3R-A2对荷S180的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细介绍，但在介绍具体实施例前，首先对本专利技术中所用到部分实验试剂及实验设备等情况简要介绍如下。生物材料：S180细胞（鼠肉瘤细胞）、HUVECs（人脐静脉内皮细胞），购买于ATCC（American Type Culture Collection）；白兰鸡鸡胚，购买于郑州市某市场；SPF级5~8周龄BALB/c雌鼠（50只），购买于河南省实验动物中心；实验试剂：Fmoc多肽固相合成的Rink树脂、Fmoc保护的L型氨基酸，为吉尔生化（上海）有限公司产品；Fmoc多肽固相合成中的洗涤试剂、1-羟基苯并三唑（HOBt）、N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇（MeOH）、二氯甲烷（DCM）、茚三酮、六氢吡啶、哌啶、醋酸酐、三氟乙酸（本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于NK3受体合成肽NK3R‑A2，其特征在于，该合成肽分子量为：1536.70 Da，序列如SEQ ID NO.1所示，其中第11位氨基酸为甲基化修饰的苯丙氨酸；该合成肽的具体氨基酸序列为：Cys‑Asn‑Gly‑Arg‑Cys‑Gly‑Gly‑Asp‑Phe‑Phe‑MePhe‑Gly‑Leu‑Met‑NH2；即：CNGRCGGDFF(MeF)GLM‑NH2。

【技术特征摘要】
1.一种基于NK3受体合成肽NK3R-A2，其特征在于，该合成肽分子量为：1536.70 Da，序列如SEQ ID NO.1所示，其中第11位氨基酸为甲基化修饰的苯丙氨酸；该合成肽的具体氨基酸序列为：Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-M...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鲤翔，陈思伟，石梁，王婷，王成功，祁元明，安秀丽，高艳锋，李国栋，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41