本发明专利技术公开了一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法。本发明专利技术通过粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析等提取纯化得到胰蛋白酶。该发明专利技术为胰蛋白酶的制备提供了一种新的材料来源，同时为草鱼内脏的合理回收及应用提供了理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶学、及其分离或纯化方法
，具体地说涉及一种从胰脏中提 取及纯化胰蛋白酶的方法。
技术介绍
胰蛋白酶（trypsin，EC3. 4. 21. 4)为丝氨酸蛋白酶类的一种。在脊椎动物体内作 为消化酶而起作用。该酶在胰脏是作为酶的前体-胰蛋白酶原而被合成的。随胰液分泌到 小肠中，受肠激酶，或胰蛋白酶的作用成为活化胰蛋白酶。胰蛋白酶是肽链内切酶，它能把 多肽链中赖氨酸（Lys)和精氨酸（Arg)残基中的羧基侧切断，酶切作用专一性强。它不仅 起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起 到活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工 具。 在多种鱼类肝胰脏和幽门垂中，胰蛋白酶以酶原形式分泌，进入消化道后在肠激 酶和Ca2+的作用下，去除激活肽后成为有活性的胰蛋白酶。草鱼为中国主要淡水鱼类养殖 对象，分布于中国各大水系，肉味美，营养丰富且易养殖，是一种很好的经济动物。有研究报 道草鱼的胰脏蛋白酶活性较高，对其内脏蛋白酶的相关研究可以为草鱼内脏的合理利用提 供理论基础，同时胰蛋白酶的制备提供了一种新的材料来源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了。 本专利技术的技术方案是：将草鱼胰脏经粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、 DEAE-Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析得到胰蛋白酶纯品，包括 如下步骤： (1)粗提液的制备：取清洗干净的草鱼胰脏，加入pH 7. 0~9· 0的含0· 01~0· lmol/L NaCl、0.001~0. 005 mol/L CaCl2 的0.02111〇1/1 Tris-HCl 缓冲液，高速匀质机（10~20sec/ 次)捣碎20~30次；12000~15000rpm，4°C离心15~20分钟，收集上清作为胰蛋白酶粗提液。 (2)硫酸铵分级沉淀： ?::向粗提液加固体硫酸铵至1〇%~30%饱和度，静置l~2h，12000~15000rpm，4Γ离心 15~20分钟； Π :向上清液中继续添加硫酸铵至加硫酸铵至60%~70%饱和度；静置l~2h， 12000~15000rpm, 4Γ离心 15~20 分钟； IlI :沉淀用上述同样的Tris-HCl缓冲液溶解后进行透析15~20h，期间更换3~5次透 析液，每次透析液用量为样品体积的15~20倍；透析后12000~15000rpm，4°C离心15~20分 钟；上清液用3~5层纱布过滤后得层析用酶液。 (3) DEAE-S印hacel 阴离子交换层析：用 pH 7. 0~9· 0 的含 0· 01~0· lmol/L NaCl、 0· 001~0· 005 mol/L CaC12 的 0· 02mol/L Tris-HCl 缓冲液平衡 DEAE-S印hacel 层析柱； 将酶液上样于层析柱后，先用同样的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未结合的蛋白，再换用pH 7· 0~9· O的含0· 05~0· 5mol/L NaCl 0· 02mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测，收集酶活 性部分，超滤浓缩。 (4) S印hacryl-200 凝胶过滤层析：用含 pH 7. 0~9· 0 的含 0· 1~0· 3mol/L NaCl 的 0. 02mol/L Tris-HCl缓冲液平衡S印harcyl S-200凝胶柱，将上述浓缩液上样于该柱，用同 样的含NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪检测并记录洗脱酶活性峰，洗脱液经4°C 透析过夜，冷冻干燥得胰蛋白酶纯品。【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例 所述的利用将草鱼胰脏经粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子 交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析得到胰蛋白酶纯品，包括如下步骤： (1)粗提液的制备：取清洗干净的草鱼胰脏，加入pH 7. 8的含0· 05mol/L NaCl、0. 002 mol/L CaCl2 的0.02111〇1/1 Tris-HCl 缓冲液，高速匀质机 20sec/次捣碎 25 次；13000,4°C 离心15分钟，收集上清作为胰蛋白酶粗提液。 (2)硫酸铵分级沉淀： ?::向粗提液加固体硫酸铵至20%饱和度，静置I. 5h，13000rpm，4Γ离心15分钟； :向上清液中继续添加硫酸铵至加硫酸铵至70%饱和度；静置I. 5h，13000rpm，4Γ 呙心15分钟； :沉淀用上述同样的TriS-HCl缓冲液溶解后进行透析16h，期间更换5次透析液， 每次透析液用量为样品体积的20倍；透析后13000, 4°C离心15分钟；上清液用4层纱布过 滤后得层析用酶液。 (3)DEAE-S印hacel阴离子交换层析：加入pH7·8的含0·05mol/LNaCl、0·002 mol/L CaCl2的0.02111〇1/1 Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-S印hacel层析柱；将酶液上样于层 析柱后，先用同样的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未结合的蛋白，再换用pH 7. 8的含0. 2mol/L NaCl 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩。 (4)S印hacryl-200 凝胶过滤层析：用含 pH 7. 8 的含 0· 25mol/L NaCl 的 0· 02mol/ L Tris-HCl缓冲液平衡S印harcyl S-200凝胶柱，将上述浓缩液上样于该柱，用同样的含 NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪检测并记录洗脱酶活性峰，洗脱液经4°C透析过 夜，冷冻干燥得胰蛋白酶纯品。 以上所述，仅是本专利技术的较佳实施例而已，并非是对本专利技术作其它形式的限制，任 何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更或改型为等同变化的等 效实施例。但是凡是未脱离本专利技术技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本专利技术技术方案的保护范围。【主权项】1. ，其特征在于：将草鱼胰脏经粗提液的制 备、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析得到 膜蛋白酶纯品。2. 根据权利要求1所述的提取纯化胰蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步 骤： (1) 粗提液的制备：取清洗干净的草鱼胰脏，加入Tris-HCl缓冲液，高速匀质机捣碎， 离心，收集上清作为胰蛋白酶粗提液； (2) 硫酸铵分级沉淀： I::向粗提液加固体硫酸铵至较低饱和度，静置，离心，取上清； 盡：向上清液中继续添加硫酸铵至较高饱和度，静置，离心收集沉淀； 議：沉淀用上述同样的Tris-HCl缓冲液溶解后进行透析，透析后的样品离心，过滤得 上清液； (3)DEAE-Sephacel阴离子交换层析：用Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sephacel层析柱； 将酶液上样于层析柱后，先用同样的Tris-HCl缓冲液冲洗掉未结合的蛋白，再换用含一定 浓度NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱，紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩； (4) Sephacryl-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法，其特征在于：将草鱼胰脏经粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、DEAE‑Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl‑200凝胶过滤层析得到胰蛋白酶纯品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘乃山，于晓娜，刘翠珍，
申请(专利权)人：青岛康原药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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