一种蛋白提取和分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种蛋白提取和分离纯化方法，所述蛋白提取和分离纯化方法包括卵粘蛋白分离纯化方法、鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法和鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法；本发明专利技术采用先稀释后均质的方法，蛋清液经生理盐水稀释后均质，不仅降低了蛋清液的黏度，而且破坏了其复杂的结构，从而使蛋清液过滤速度较快，膜清洗较为容易，降低了膜的污染程度，延长了膜的使用寿命当操作压力在0.15MPa时，处于相对平稳的流通状态，且在一定程度上一直滤液浓差极化现象。本发明专利技术以已水稀释法为基础，并结合聚乙二醇沉淀以及DEAE‑Toyopearl 650M一步洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡卵黄IgY。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于糖蛋白
，尤其涉及一种蛋白提取和分离纯化方法。
技术介绍
鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究和胰蛋白酶的亲和层析纯化制备。分子量:28000Da，分子由四个分子量相近的亚基组成糖蛋白组成，即D-甘露糖，D-半乳糖，葡萄糖胺，唾液酸；化学稳定性，耐热:在80℃条件下，理化性质不发生改变，耐有机溶剂:在50％的丙酮溶液中，能保持良好的溶解度，耐沉淀剂:在10％的TCA的溶液中不发生沉淀。等电点性质，等电点:pI在3.9-4.5之间，溶液中的状态:在pH3.0的溶液中稳定，在pH8.0的溶液中容易分解。鸡卵黄免疫球蛋白，简称IgY，又称鸡卵黄抗体。具有免疫原性，在蛋黄中以α-、β-和γ-卵黄球蛋白三种形式存在。目前国际上采用的IgY分离纯化方法主要包括水稀释法、有机溶剂抽提沉淀法、超滤、超临界萃取法与冻融等物理化学法及盐析与DEAE色谱相结合等方法。国内外有关于从鸡蛋清中分离提取活性物质已有较多研究和报道，且已有相关的工业化生产并产生了良好的经济效益，如溶菌酶，免疫球蛋白等。而从鸡蛋清中提取卵转铁蛋白的研究主要还停留在实验室规模，并未实现工业化生产，研究进展相对缓慢。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蛋白提取和分离纯化方法，旨在解决
技术介绍
中所述的问题。本专利技术是这样实现的，一种蛋白提取和分离纯化方法，所述蛋白提取和分离纯化方法包括卵粘蛋白分离纯化方法、鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法和鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法；所述卵粘蛋白分离纯化方法采用GaCL2或MgCl2制备卵粘蛋白；所述鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法包括：新鲜鸡蛋清原液，0.9生理盐水稀释，3000r/min离心15min去除卵粘蛋白，再用等电点盐析除去卵白蛋白；经离心和等电点沉淀的样品微滤除去0.1-100μm范围的杂质，进而采用超滤，用聚砜树脂衍生物膜去除100kDa以上大分子蛋白质，再用聚砜树脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白质，得浓缩液，得到的浓缩液进行透析处理，并冷冻干燥；所述鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法采用已水稀释法结合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl 650M一步洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡卵黄IgY。进一步，所述卵粘蛋白分离纯化方法包括以下步骤：全蛋清搅拌均匀后加5倍体积的盐溶液，0.05mol/LMgCl2或0.1mol/L NaCl，均质后用0.1mol/L HCl调pH＝6.0，4℃静置过夜，15，000g离心10min，4℃，沉淀用0.5mol/L NaCl重悬，4℃放置4h，15，000g离心10min，4℃，将得到的沉淀双蒸水洗涤至上清中不含蛋白质，沉淀部分即为卵粘蛋白粗提物；粗提物溶解于10mmol/L硼酸盐酸缓冲液pH＝9.6中配成5mg/ml溶液，4℃搅拌过夜，0.45μm微孔滤膜过滤后进行凝胶层析，洗脱液为含0.2mol/LMgCl2的Tris-HCl缓冲液，20mmol/L，pH＝8.4，流速0.5ml/min；收集各洗脱峰的冻干样品经SDS-PAGE进行鉴定，目标组分冷冻干燥后-20℃保存。进一步，所述卵粘蛋白对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为0.05mg/mL和0.2mg/mL。进一步，所述鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法包括：连接好超滤装置，通过0.2MPa超纯水压力持续1h，待水流通量稳定后，测定超滤膜初始纯水通量，超滤完毕后，取出超滤膜进行蒸馏水冲洗，并用0.1M NaOH和0.1M HCl浸泡30min，最后用蒸馏水反复冲洗，再次测定膜纯水流通量；新鲜鸡蛋清原液，0.9生理盐水稀释，3000r/min离心15min去除卵粘蛋白，再用等电点盐析除去卵白蛋白；经离心和等电点沉淀的样品微滤除去0.1-100μm范围的杂质，进而采用超滤技术，用聚砜树脂衍生物膜去除100kDa以上大分子蛋白质，再用聚砜树脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白质，得浓缩液，之后得到的浓缩液进行透析处理，并冷冻干燥。进一步，所述蛋白提取和分离纯化方法的超滤装置压力为0.15MPa,0.9生理盐水稀释倍数为10倍，搅拌速率为125r/min，此时膜通量值为39.80，pH为7。进一步，所述鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法包括：选取新鲜鸡蛋，采用蛋清蛋黄分离器，分离得到蛋黄，用蒸馏水将蛋黄洗净，置于滤纸上吸干，刺破蛋黄膜，收集蛋黄液，以体积百分比计，用蒸馏水对蛋黄进行不同倍数的稀释8倍搅拌均匀，调节不同pH值5.0～5.6，4℃静置不同时间(2h、4h、6h、8h、10h)，5000×冷冻离心30min后，得澄清上清液含IgY水溶性组分WSF；向所得的WSF中加入不同质量分数的PEG6000，磁力搅拌器搅拌30min，22000×g冷冻离心，收集沉淀；透析，收集沉淀加入蒸馏水，搅拌，装入透析袋，截留分子量为8000-14000KD中，4℃透析除去部分残留PEG6000，冷冻干燥即得粗IgY组分；离子交换色谱法纯化IgY，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液平衡，设置pH值为6.0，7.0，8.0条件下不同缓冲液离子强度(0.03mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L)上样平衡、恒流洗脱(0.075mol/L，0.1mol/L)，洗脱流出液按每管5ml/3min自动收集；将层析所收集的组分装入透析袋截留分子量为8000-14000KD，置于蒸馏水中，4℃透析除盐。本专利技术提供的蛋白提取和分离纯化方法，采用GaCL2与MgCl2结合的方法制备卵粘蛋白效果最佳，制备的卵粘蛋白纯度﹥97％，采用该方法制备的卵粘蛋白纯度大于97％，终产量408.65±4.32mg/100g蛋清，回收率为(85.3±1.08)％。经凝胶过滤分离，成功分离得到纯卵粘蛋白为302.1mg,总得率为57.03％。本专利技术采用先稀释后均质的方法，蛋清液经生理盐水稀释后均质，不仅降低了蛋清液的黏度，而且破坏了其复杂的结构，从而使蛋清液过滤速度较快，膜清洗较为容易，降低了膜的污染程度，延长了膜的使用寿命当操作压力在0.15MPa时，处于相对平稳的流通状态，且在一定程度上一直滤液浓差极化现象。本专利技术以已水稀释法为基础，并结合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl650M一步洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡卵黄IgY。附图说明图1是本专利技术实施例提供的蛋白提取和分离纯化方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的ovomucin对大肠杆菌生长曲线影响示意图。图3是本专利技术实施例提供的ovomucin对沙门氏菌生长曲线影响示意图。图4是本专利技术实施例提供的ovomucin对金黄色葡萄球菌生长曲线影响示意图。图5是本专利技术实施例提供的卵转铁蛋白超滤分离的工艺流程图。图6是本专利技术实施例提供的稀释倍数对鸡蛋清液相对粘度的影响示意图。图7是本专利技术实施例提供的剪切速率对鸡蛋清液相对粘度的影响示意图。图8是本专利技术实施例提供的温度对鸡蛋清液相对粘度的影响示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述蛋白提取和分离纯化方法包括卵粘蛋白分离纯化方法、鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法和鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法；所述卵粘蛋白分离纯化方法采用GaCL2或MgCl2制备卵粘蛋白；所述鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法包括：新鲜鸡蛋清原液，0.9生理盐水稀释，3000r/min离心15min去除卵粘蛋白，再用等电点盐析除去卵白蛋白；经离心和等电点沉淀的样品微滤除去0.1‑100µm范围的杂质，进而采用超滤，用聚砜树脂衍生物膜去除100kDa以上大分子蛋白质，再用聚砜树脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白质，得浓缩液，得到的浓缩液进行透析处理，并冷冻干燥；所述鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法采用已水稀释法结合聚乙二醇沉淀以及DEAE‑Toyopearl 650M一步洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡卵黄IgY。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述蛋白提取和分离纯化方法包括卵粘蛋白分离纯化方法、鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法和鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法；所述卵粘蛋白分离纯化方法采用GaCL2或MgCl2制备卵粘蛋白；所述鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法包括：新鲜鸡蛋清原液，0.9生理盐水稀释，3000r/min离心15min去除卵粘蛋白，再用等电点盐析除去卵白蛋白；经离心和等电点沉淀的样品微滤除去0.1-100µm范围的杂质，进而采用超滤，用聚砜树脂衍生物膜去除100kDa以上大分子蛋白质，再用聚砜树脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白质，得浓缩液，得到的浓缩液进行透析处理，并冷冻干燥；所述鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法采用已水稀释法结合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl 650M一步洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡卵黄IgY。2.如权利要求1所述的蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述卵粘蛋白分离纯化方法包括以下步骤：全蛋清搅拌均匀后加5倍体积的盐溶液，0.05mol/LMgCl2或0.1mol/L NaCl，均质后用0.1mol/L HCl调pH=6.0，4℃静置过夜，15，000g离心10min，4℃，沉淀用0.5mol/L NaCl重悬，4℃放置4h，15，000 g离心10min，4℃，将得到的沉淀双蒸水洗涤至上清中不含蛋白质，沉淀部分即为卵粘蛋白粗提物；粗提物溶解于10mmol/L硼酸盐酸缓冲液pH=9.6中配成5mg/ml溶液，4℃搅拌过夜，0.45µm微孔滤膜过滤后进行凝胶层析，洗脱液为含0.2 mol/LMgCl2的Tris-HCl缓冲液，20mmol/L， pH=8.4，流速0.5ml/min；收集各洗脱峰的冻干样品经SDS-PAGE进行鉴定，目标组分冷冻干燥后-20℃保存。3.如权利要求2所述的蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述卵粘蛋白对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为0.05mg/mL和0.2mg/mL。4.如权利要求1所述的蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨涛，刘岩，都韧宁，于寒松，
申请(专利权)人：吉林厚德食品有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22