一种酵母表达的鸡Cathelicidin1抗菌肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种利用毕赤酵母表达的重组鸡Cathelicidin1抗菌肽，并进一步公开其制备方法与应用。本发明专利技术所述制备重组鸡Cathelicidin1抗菌肽的方法，选择pPICZαA分泌型表达载体作为外源基因的真核表达体系，使重组鸡Cathelicidin1抗菌肽获得高效表达，并避免表达产物对宿主细胞造成直接的杀伤性。同时本方法表达效率高，表达产物分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适用于大规模工业化生产。经试验证实Cathelicidin1抗菌肽与抗生素联合使用，对多种革兰氏阳性菌、阴性菌均有明显的协同抑菌作用，具有广阔的应用推广前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用毕赤酵母表达的重组鸡Cathelicidin1抗菌肽，并进一步公开其制备方法与应用。
技术介绍
一直以来，我国家禽养殖业深受多种传染性疾病的困扰，而严重影响了家禽业的发展。自抗生素发现以来，其在预防细菌感染、防治畜禽疾病等方面已经发挥了很重要的作用，对促进畜牧业和家禽业的健康、快速发展起到了巨大的推动作用。但长期大量使用抗生素类药物也带来了一系列的负面隐患。一方面，抗生素的大量使用使得病原菌逐步产生耐药性，为疾病的防治工作增加了难度；另一方面，使用抗生素而引发的药物残留也使得动物性食品的安全性问题日益突出，而耐药质粒容易交叉散播传给人类，也给人类健康和疾病的预防与治疗带来威胁。因此，国际社会已经明确提出减少抗生素使用量或取消某些抗生素的使用的规定。抗菌肽(antimicrobialpeptide)是动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌活性等优势，对革兰氏阴性菌(G-)、革兰氏阳性菌(G+)、真菌、原生生物、有被膜的病毒和肿瘤细胞均表现出较强的活性，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程；对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌也表现了较好的杀灭作用。而且绝大多数抗菌肽不同于传统抗生素的独特抗菌机制，对哺乳动物的正常细胞无毒害作用，对机体也无任何毒副作用、无残留，这将为解决细菌对青霉素等传统抗生素日益增强的耐药性这一棘手的全球性难题提供新途径，可见，抗菌肽广泛的生物学活性显示了其在医学上良好广阔的应用前景。迄今为止，已从包括动物、植物、昆虫、原核生物等多种生物体内分离、鉴定了千余种抗菌活性肽，有几十种抗菌肽已进入临床试验或临床前研究阶段。目前在家禽体内发现的抗菌肽包括如下三类：即防御素类(Gallinacin)、Cathelicidin类和肝内表达抗菌肽2(LEAP-2)。Cathelicidin类抗菌肽是最初被发现于哺乳动物的一类结构多变的抗菌肽，因其在信号肽与成熟肽之间含有一高度保守的Cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidin1在体外具有很强的广谱抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的活性，有的在50％血清和生理盐浓度下仍有杀菌活性。除了主要的杀灭细菌、真菌和病毒活性外，Cathelicidin还具有对免疫细胞的趋化作用、抑制组织损伤、促进创伤修复、结合内毒素、诱导血管生成等多种生物学功能。同防御素一样，Cathelicidin抗菌肽也是宿主防御系统的重要组成部分，但它们通常更耐盐和溶媒。由于具有如此广泛的生物学活性和功能，Cathelicidin抗菌肽已成为免疫学、分子生物学和生物医药领域内的研究热点，其药用开发前景十分广阔。现已证实利用原核表达系统表达的Cathelicidin1具有广泛的抑菌活性。然而，由于家禽体内天然抗菌肽的含量极低并且分子量小，导致其分离纯化十分困难，远远无法满足市场需要。因此，化学合成与基因工程方法就成为获得抗菌肽的主要手段，但目前化学合成抗菌肽的工艺较为复杂、成本也较高，难于应用于临床之用；因此，通过基因工程的方法在特定宿主内大量表达抗菌肽就成为一条有效的途径。现有的抗菌肽表达体系主要包括大肠埃希菌、酵母菌、昆虫细胞/杆状病毒群蛋白表达系统和哺乳动物细胞等4种。最初抗菌肽基因表达研究是在原核表达系统中进行的，但运用该系统表达抗菌肽则比较困难，主要表现在3个方面：(1)大肠埃希菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质翻译后加工修饰能力，其产物往往形成没有活性的包涵体，须经过变性、复性等处理才能应用；(2)抗菌肽对宿主细胞的毒性，宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性抑制大肠埃希菌的增殖，影响抗菌肽的进一步表达；(3)容易被降解，抗菌肽本身带有大量的正电荷，对蛋白酶非常敏感，在大肠埃希菌中容易降解，难以实现大量表达。因此抗菌肽基因只能以融合蛋白的形式在大肠埃希菌中表达。目前在采用酵母表达系统表达抗菌肽的研究方面取得了较大的成功，酵母表达系统具有表达产物可以糖基化、分泌性表达、表达量高、利于产物分离纯化、适应工业化生产等优点。研究发现，在以酵母为宿主菌的抗菌肽基因工程中，多数研究都实现了目的蛋白的表达，产物对工程菌没有明显的抑制作用，表明抗菌肽对酵母的毒性较小，适于在该系统中表达。为了使表达量增高，采用了各种不同的表达策略，直接表达、融合表达、改造后表达、串联表达和复合表达等，都有一定的预期结果，说明应用酵母表达抗菌肽具有很好的开发前景。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种重组鸡Cathelicidin1抗菌肽，并进一步提供一种基因工程方法制备所述重组鸡Cathelicidin1抗菌肽的方法。为解决上述技术问题，本专利技术所述的重组鸡Cathelicidin1抗菌肽，其成熟肽包含如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本专利技术还提供了一种编码所述的重组鸡Cathelicidin1抗菌肽的基因，其包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种含有所述重组鸡Cathelicidin1抗菌肽基因的表达载体。所述表达载体为重组质粒pPICZαA-CathL1。本专利技术还提供了一种含有所述的表达载体的重组菌，所述的重组菌为生产鸡Cathelicidin1抗菌肽的毕氏酵母工程菌。所述重组菌为分泌型重组酵母表达菌株X-33/pPICZαA-CathL1。本专利技术还提供了一种构建所述重组菌的方法，即将所述的表达载体导入毕氏酵母宿主菌株，以使所述表达载体在所述宿主中有效表达。所述的构建所述重组菌的方法，包括如下步骤：(1)以成年乌骨鸡骨髓RNA为模板，扩增其Cathelicidin1成熟肽的编码序列，克隆至pMD18-T载体中，筛选阳性克隆并测序验证；(2)将Cathelicidin1成熟肽的编码序列与分泌型酵母表达载体pPICZαA相连接，筛选阳性克隆，并大量制备阳性质粒pPICZαA-CathL1；(3)将pPICZαA-CathL1重组质粒经酶切线性化后利用电穿孔导入PichiapastorisX-33宿主细胞基因组中，获得分泌型重组酵母表达菌株X-33/pPICZαA-CathL1；并将转化子经甲醇利用表型的MM/MD平板筛选，得到能够正常利用甲醇的重组酵母菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组鸡Cathelicidin1抗菌肽，其特征在于：其成熟肽包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组鸡Cathelicidin1抗菌肽，其特征在于：其成熟肽包含如SEQ
IDNO:2所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的重组鸡Cathelicidin1抗菌肽的基因，其
特征在于：其包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
3.一种含有权利要求2所述重组鸡Cathelicidin1抗菌肽基因的表达载
体。
4.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重
组质粒pPICZαA-CathL1。
5.一种含有权利要求3或4所述的表达载体的重组菌，其特征在于：
所述的重组菌为生产鸡Cathelicidin1抗菌肽的毕氏酵母工程菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为分泌型
重组酵母表达菌株X-33/pPICZαA-CathL1。
7.一种构建权利要求5或6所述重组菌的方法，其特征在于：将权利
要求3或4所述的表达载体导入毕氏酵母宿主菌株，以使所述表达载体在
所述宿主中有效表达。
8.根据权利要求7所述的构建所述重组菌的方法，其特征在于，包括
如下步骤：
(1)以成年乌骨鸡骨髓RNA为模板，扩增其Cathelicidin1成熟肽的
编码序列，克隆至pMD18-T...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兵，马秀丽，于可响，刘存霞，吴静，史玉颖，胡峰，李玉峰，宋敏训，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所山东省无特定病原鸡研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37