本发明专利技术公开了一种合江棘蛙cathelicidin抗菌肽cathelicidin‑PR1，它是具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的蛋白，或者是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。本发明专利技术克隆得到合江棘蛙抗菌肽cathelicidin‑PR1的编码基因，并利用化学合成的方法合成了cathelicidin‑PR1。该抗菌肽分子量小，呈α‑螺旋的两亲性结构，杀菌作用快，对嗜麦芽假单胞菌7404、金黄色葡萄球菌（宋）、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌08030102和光滑念珠菌08A802具有强的杀灭作用。此外，还具有极低的溶血活性和抗氧化活性，不具有红细胞凝集活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子遗传学领域，尤其是一种合江棘蛙抗菌肽及编码序列的基因与应 用。
技术介绍
随着青霉素等传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越 来越强的耐受性，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物， 已有的抗生素对这些病原微生物无能为力。抗菌肽是一种新型的抗微生物多肽，大多数抗 菌肽分子量小于10000 Da，带正电，富含疏水碱基，能够形成两亲性的结构。抗菌肽的杀菌 机制主要是通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞 膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。而传统抗生 素主要是作用于细菌细胞内的一些酶类。正是由于作用方式的不同，抗菌肽介导的杀菌作 用远远快于传统抗生素，并且不易使细菌产生耐受性。除此之外，越来越多的文献报道表明 抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、 激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。 Cathelicidin家族抗菌肽具有高效、广谱、稳定、不易产生耐药性、具选择性毒性 等特点，因其前体肽包含一段高度保守的中间cathelicin区域而得名。Cathelicidin家 族抗菌肽是脊椎动物体内一个重要的抗菌肽家族，是脊椎动物先天免疫系统中的重要组 分，在脊椎动物抵御外界微生物侵袭过程中发挥了重要的作用。Cathelicidin家族是一 个多功能的宿主防御肽家族，在抵御外界微生物感染的第一道防线中发挥着重要作用。到 目前为止，已从各种脊椎动物(包括哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类动物）体内发现了 cathelicidins家族抗菌肽。 Cathelicidin其前体由N-端信号肽区域（29~30个氨基酸残基）、保守的中间 cathelin区域（94~114个氨基酸残基）和高度特异的C-末端成熟肽区域（12~100 个残基）构成。该家族抗菌肽具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、 霉菌、原虫和部分包膜病毒均有活性。Cathelicidin抗菌肽富含带正电荷的氨基酸残基， 很少或不含带负电荷的残基，因此都带正电荷，与其他家族相比阳离子化程度更高，如与 Defensins、昆虫抗菌肽和蛙科皮肤来源抗菌肽相比，抗菌活性更强，最小抑菌浓度可达到 μΜ，而且杀菌作用迅速，有些可在1分钟内杀死临床分离的病菌。体外抗微生物测试中， 大多数cathelicidins可以在微摩尔和亚微摩尔的浓度下快速杀死广泛的微生物。有些 cathelicidins对许多临床分离耐药菌具有极强活性，如猪来源的PR-39对甲氧西林耐药 的金黄色葡萄球菌活性极强。 Cathelicidin抗菌肽的多功能性不仅表现在抗微生物活性，作为预警分子参与 免疫调节反应，还具有如抑制组织损伤、促进伤口修复和血管生成、结合内毒素等作用。 Cathelicidin家族抗菌肽的这些功能使其在耐抗生素病原菌株大量涌现的今天有望成为 新一代的临床抗菌药物。 研宄发现Cathelicidin家族抗菌肽通常带有大量正电荷，当在膜环境时会 形成带正电荷的表面，利用静电相互作用结合到带负电荷的细菌细胞膜上。绝大多数 Cathelicidins具两亲性的α -螺旋或β -片层结构，疏水侧能迅速结合到带负电荷的细菌 细胞膜上，插入膜内部，亲水侧暴露于膜外，致使细胞膜受损，通透性变大，最终导致细菌内 容物外泄死亡。这种独特的作用机理较抗生素而言，很难使细菌产性耐药性。 Cathelicidins家族抗菌肽在脊椎动物抵御外界微生物侵袭过程中发挥了重要的 作用，该家族抗菌肽具有强抗菌活性、弱细胞毒性和不易产生耐药性等特征。其优良的性质 与独特的作用机理是新型多肽类抗菌药物开发的优秀候选分子和模板。目前，国外对多种 cathelicidins抗菌肽进行了研宄开发，以其为模板的抗感染和消炎药物已有多种进入临 床试验阶段，如Iseganan (由猪的cathelicidin抗菌肽protegrin改造而来）用于治疗呼 吸系统和口腔黏膜的感染，〇miganan(由牛的cathelicidin抗菌肽Indolicidin改造而来） 用于治疗细菌性和真菌性感染，等。 当前人类对食品安全的关注越来越重视，食品中防腐剂、保鲜剂的要求越来越严 格，致使天然防腐剂的需求猛增，cathelicidin抗菌肽抗菌谱广、活性强，用于食品的储藏 和保鲜，既安全又健康，将给人们的生活带来更多幸福。饲料工业是工农业生产中的关键产 业，传统抗生素在预防和治疗动植物疾病方面发挥着重要作用，但其副作用和耐药性的增 加逐渐显现出其劣势，研发绿色健康的抗菌肽，作为饲料添加剂用于禽畜和水产养殖，减少 养殖业对药物的依赖，其意义和潜在价值巨大。cathelicidin抗菌肽在这些领域的应用也 是极具前景。 合江棘娃隶属于两栖纲（Amphibia)、无尾目（Caudata)、娃科（Ranidae)、棘娃属 (/??),是中国特有种，体型硕大，生存于海拔650-1500米的山溪及其附近。当前对其研宄 极少，主要是对发现和分布地研宄。有关合江棘蛙抗菌肽的研宄还没有任何报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种合江棘娃抗菌肽cathelicidin-PRl。 toon] 本专利技术还要解决的技术问题是提供上述蛋白的编码序列。 本专利技术还要解决的技术问题是提供上述蛋白在制备食品添加剂或动物饲料添加 剂的应用。 本专利技术是这样实现的：一种合江棘娃（/?? roAeriiflgeri) cathelicidin抗菌肽 cathelicidin-PRl，它是具有序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列编码的蛋白。 所述的合江棘娃抗菌肽cathelicidin-PRl具有序列表中SEQ ID NO :2所示的氨 基酸序列；该合江棘蛙抗菌肽cathelicidin-PRl为α -螺旋结构多肽，含有29个氨基酸残 基，分子量为3195. 88 Da，等电点为10. 59,具一条分子内二硫键。 合江棘娃抗菌肽cathelicidin-PRl的编码基因，它是下列核苷酸之一： (1) 序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列； (2) 编码序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的多核苷酸。 合江棘娃抗菌肽cathelicidin-PRl在制备抗微生物药物中的应用。 有益效果 本专利技术克隆得到合江棘蛙抗菌肽cathelicidin-PRl的编码基因，并利用化学合成的 方法合成了 cathelicidin-PRl。该抗菌肽分子量小，对临床分离的嗜麦芽假单胞菌、金黄色 葡萄球菌、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌08030102和光滑念珠菌具有强的杀 灭作用。此外还具有低的溶血活性、抗氧化活性和红细胞凝集活性。【具体实施方式】 根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。 本专利技术的实施例1 :合江棘娃抗菌肽cathelicidin-PRl基因克隆。 1)合江棘蛙皮肤总RNA提取： ①用剪刀本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种合江棘蛙cathelicidin抗菌肽cathelicidin‑PR1，其特征在于：它是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列编码的蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周江，李灿，殷梦光，王义鹏，
申请(专利权)人：贵州师范大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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