【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及acsl4基因缺失的mdck纯合子细胞系的构建方法和应用。
技术介绍
1、酰基辅酶a合成酶长链家族成员4(acyl-coa synthetase long chain familymember,acsl4)是调节脂质成分的关键酶，它催化长链脂肪酸和辅酶a反应生成酯酰辅酶a。这个步骤使长链脂肪酸活化进行脂类合成和能量代谢，发生脂质过氧化，进而促进细胞铁死亡的发生。
2、犬肾细胞(mdck，madin-darby canine)，被广泛用于畜禽多种呼吸道、肠道病毒的分离、培养和纯化，具有易于培养、生长速度快、稳定性和可塑性强，可以形成单层细胞膜等优点。基因敲除技术通常是采用同源重组技术将构建完成的基因敲除载体导入到受体细胞中，利用碱基序列同源而重组的原理，将载体dna定向整合到受体细胞基因组上某一个确定的位点处，最终可以使特定的基因功能丧失作用，从而使这一基因调控的部分功能被屏蔽，可进一步分析判断其对生物体各方面造成影响。
3、基于研究acsl4基因参与的各种细胞活动的需要，如通过调控其介导的细胞铁死亡、进一步通过激活或阻断铁死亡活动进行研究，acsl4基因缺失的稳定细胞株有望作为良好的研究目标。目前尚未有acsl4基因缺失的mdck细胞构建的相关报道。
4、本研究将mdck细胞的acsl4基因敲除，获得acsl4基因缺失的mdck细胞纯合子，经过3次传代并冻存，可稳定复苏繁殖，并保持稳定的生理特性。这对研究acsl4基因参与的各种细胞活动，缓解或治疗多种疾病，意义重大
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供acsl4基因缺失的mdck纯合子细胞系的构建方法和应用。该构建方法采用特异性grna高效靶向acsl4基因，结合crispr/cas9基因编辑技术敲除犬肾细胞mdck的acsl4基因，安全快捷、脱靶效应低，脱靶率低于30％。
2、本专利技术提供了如下技术方案之一：
3、用于靶向敲除acsl4基因的特异性grna，所述grna在acsl4基因的靶向位点位于acsl4基因的366-344位点(genbank no：xm038588058)；该特异性grna的核苷酸序列为seqid no.1：grna-a1:tatccagagtgtcagctccgggg。
4、进一步地，本专利技术crispr/cas9系统，包括如上所述的特异性grna。所述crispr/cas9系统包含crispr基因座和cas基因(crispr关联基因)两部分。crispr基因序列主要由前导序列(leader)、重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)构成。cas基因位于crispr基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与crispr序列区域共同发生作用。该crispr/cas9系统是一种由rna引导cas9蛋白对靶基因进行修饰的系统，与传统的基因编辑技术相比，具有编辑效率高、编辑位点更精准、脱靶机率低、验证成本低、操作简单等优势。
5、本专利技术提供了如下技术方案之二：
6、acsl4基因缺失的mdck纯合子细胞的构建方法，包括如下操作步骤：
7、(1)将步骤(1)制得的特异性grna和cas9蛋白以1:3体积比电转化至mdck细胞；
8、(2)挑选单克隆并通过pcr及测序验证，获得acsl4基因敲除的mdck纯合细胞。
9、进一步地，步骤(2)电转参数采用：c＝25μf,pc＝200ω,v＝1.8kv；步骤(3)pcr所用引物如seq id no.2和seq id no.3所示。
10、本专利技术提供了如下技术方案之三：
11、一种mdck纯合子细胞系，由以上构建方法构建而成。
12、本专利技术提供了如下技术方案之四：
13、上述mdck纯合子细胞系在建立acsl4基因敲除体外细胞模型中的应用。
14、上述mdck纯合子细胞系在畜禽呼吸道、肠道病毒分离、培养和纯化中的应用。
15、本专利技术的有益效果：
16、本专利技术采用cas9 rnp系统方法，通过电转法介导的crispr/cas9基因编辑技术敲除犬肾细胞mdck的acsl4基因，安全快捷、脱靶效应低。电转后挑单克隆并通过pcr及测序验证，成功获得了acsl4基因敲除的mdck纯合细胞。本专利技术acsl4基因被敲除后的mdck细胞仍能保持其生理特性，经过多次冻存复苏可稳定繁殖传代，为研究acsl4基因参与的各种细胞活动提供了良好的模型。
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1.用于靶向敲除ACSL4基因的特异性gRNA，其特征在于，所述gRNA的核苷酸序列为gRNA-A1:TATCCAGAGTGTCAGCTCCGGGG，如SEQ ID NO.1所示。
2.ACSL4基因缺失的MDCK纯合子细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
3.根据权利要求2所述的ACSL4基因缺失的MDCK纯合子细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(3)PCR所用引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.一种MDCK纯合子细胞系，其特征在于，由权利要求3所述的构建方法构建而成。
5.根据权利要求4所述的MDCK纯合子细胞系在建立ACSL4基因敲除体外细胞模型中的应用。
6.根据权利要求4所述的MDCK纯合子细胞系在畜禽呼吸道、肠道病毒分离、培养和纯化中的应用。
【技术特征摘要】
1.用于靶向敲除acsl4基因的特异性grna，其特征在于，所述grna的核苷酸序列为grna-a1:tatccagagtgtcagctccgggg，如seq id no.1所示。
2.acsl4基因缺失的mdck纯合子细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
3.根据权利要求2所述的acsl4基因缺失的mdck纯合子细胞系的构建方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁小远，张玉霞，董雯雯，孟凯，李桂明，于志君，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所山东省无特定病原鸡研究中心，
类型：发明
国别省市：
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