一种提高尿促性素效价的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用层析技术纯化尿促性素的方法。具体的说，就是运用亲和层析和离子交换层析纯化低效价尿促性素，将效价约为30iu/mg的尿促性素效价提高到约600iu/mg,并且各项指标均符合中国药典规定。本发明专利技术方法操作简单，生产成本低，产品纯度高，更能满足临床和科研的需求。

A Method for Improving the Value of Urogenin

The invention discloses a method for purifying urinary gonadotropin by using chromatography technology. Specifically, the purified urea gonadotropin with low titer was purified by affinity chromatography and ion exchange chromatography. The titer of urea gonadotropin with a titer of about 30 iu/mg was increased to about 600 iu/mg, and all the indexes met the requirements of Chinese Pharmacopoeia. The method has the advantages of simple operation, low production cost and high product purity, and can better meet the needs of clinical and scientific research.

【技术实现步骤摘要】
一种提高尿促性素效价的方法
本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一种应用层析法来制备效价高、收率稳定的尿促性素的方法。
技术介绍
尿促性素（HMG）是由人脑下垂体前叶部分分泌的一种糖蛋白促性腺激素，一般是从绝经期或绝经期后妇女的尿液中经提取纯化而制得。HMG含有卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH），其所含比例近似1：1。临床主要用于治疗妇女因功能性不排卵所致的不育症；男性因激素水平低下所引起的精子过少或活力不足。另外，还用于治疗诸如妇女闭经、月经不调、男女之性机能失调等症。1928年Ascbheim首先报道了从更年期妇女尿液中发现了活性物质，之后报道虽不少，但真正对HMG的了解和制备，是从20世纪60年代的Donimi开始，并逐渐形成比较规范化的工艺来制备的。我国从20世纪70年代开始研究，80年代正式进入临床试验阶段，90年代开始大量生产。目前，比较经典的制备工艺是高岭土-乙醇法制备HMG粗制品，再用各种纯化方法进行纯化。国内目前常用的纯化方法收率偏低（一般小于50%），成品效价在100iu/mg左右。中国专利CN101792482A介绍了“一种促性腺激素的纯化方法”，该方法采用硅酸铝粉末作为吸附剂提取纯化HMG，但其效价仅能达到150iu/mg。在实际生产中，选用层析法纯化尿促性素,可以更有效的去除其中的多种杂蛋白，并且使其理化性质和生物活性保持稳定，从而使产品的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，使得尿促性素效价不低于600iu/mg，带来巨大的经济效益和社会效益。
技术实现思路
本专利技术提供了一种层析纯化尿促性素的方法，使尿促性素效价可稳定达到600iu/mg以上。本专利技术的技术方案是：低效价尿促性素经产品溶解、亲和层析、离子交换层析后得到高效价尿促性素，包括如下步骤：（1）尿促性素粗品用含pH6.0~8.0的含0.1~0.3mol/LNaCl、0.01~0.03mol/LEDTA的Tris-HCl缓冲液溶解，离心去沉淀，得上清液；（2）亲和层析：用pH6.0~8.0含0.1~0.3mol/LNaClTris-HCl缓冲液平衡Argmatin-Sepharose柱，上清液上柱后，用pH6.0~8.0含0.1~0.3mol/LNaCl、0.1~0.3mol/L盐酸胍的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液经超滤脱盐至无氯离子，加NaCl和1mol/LTris-HCl稀释至pH7.0~9.0含0.05~0.30mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液；（3）离子交换层析：将上述缓冲液上样于DEAE-SepharoseFastFlow柱，用pH6.0~8.0含0.01~0.20mol/LNaCl的Tris-HCl平衡液冲洗，换用pH6.0~8.0含0.1~0.3mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱。（4）紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩后冷冻干燥，即得成品；具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。实施例1（1）预处理：取尿促性素粗品按重量1:15（w/v）比例加入pH7.0的含0.2mol/LNaCl、0.02mol/LEDTA的Tris-HCl缓冲液溶解，离心去沉淀，得上清液；（2）亲和层析：用pH7.0含0.2mol/LNaClTris-HCl缓冲液平衡Argmatin-Sepharose柱，上清液上柱后，用pH7.0含0.2mol/LNaCl、0.2mol/L盐酸胍的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液经超滤脱盐至无氯离子，加NaCl和1mol/LTris-HCl稀释至pH7.0含0.20mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液；（3）离子交换层析：将上述缓冲液上样于DEAE-SepharoseFastFlow柱，用pH7.0含0.10mol/LNaCl的Tris-HCl平衡液冲洗，换用pH7.0含0.2mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱。（4）用紫外检测仪检测并记录，洗脱酶活性峰，超滤后将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得尿促性素。照《中国药典》二部，2015，第530页，尿促性素质量标准，产品符合要求。照通则1216和1217测得卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH），效价分别为657iu/mg和642iu/mg，HMG效价达到600iu/mg以上。实施例2（1）尿促性素粗品用含pH6.6的含0.15mol/LNaCl、0.015mol/LEDTA的Tris-HCl缓冲液溶解，离心去沉淀，得上清液；（2）亲和层析：用pH6.6含0.15mol/LNaClTris-HCl缓冲液平衡Argmatin-Sepharose柱，上清液上柱后，用pH6.6含0.15mol/LNaCl、0.15mol/L盐酸胍的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液经超滤脱盐至无氯离子，加NaCl和1mol/LTris-HCl稀释至pH7.5含0.15mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液；（3）离子交换层析：将上述缓冲液上样于DEAE-SepharoseFastFlow柱，用pH6.6含0.05mol/LNaCl的Tris-HCl平衡液冲洗，换用pH6.6含0.15mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱。（4）用紫外检测仪检测并记录，洗脱酶活性峰，超滤后将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得尿促性素。照《中国药典》二部，2015，第530页，尿促性素质量标准，产品符合要求。照通则1216和1217测得卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH），效价分别为662iu/mg和637iu/mg，HMG效价达到600iu/mg以上。以上所述，仅是本专利技术的较佳实施例而已，并非是对本专利技术作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本专利技术技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本专利技术技术方案的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高尿促性素效价的方法，其特征在于，方法包括：将低效价尿促性素通过亲和层析、离子交换层析进行纯化，最终得到高纯度的尿促性素，其特征在于，该方法包括如下步骤：尿促性素粗品用含NaCl、EDTA的Tris‑HCl缓冲液溶解，离心去沉淀，得上清液；亲和层析：用含NaCl的Tris‑HCl平衡液平衡Argmatin‑ Sepharose柱，上清液上柱后，用含NaCl、盐酸胍的Tris‑HCl缓冲液洗脱，洗脱液经超滤脱盐至无氯离子；（3）离子交换层析：将上述超滤脱盐后的溶液加NaCl和1mol/L Tris‑HCl稀释至一定浓度，上样于DEAE‑Sepharose Fast Flow柱，用含NaCl的Tris‑HCl平衡液冲洗，换用含不同浓度NaCl的Tris‑HCl洗脱液洗脱；紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩后冷冻干燥，即得成品。

【技术特征摘要】
1.一种提高尿促性素效价的方法，其特征在于，方法包括：将低效价尿促性素通过亲和层析、离子交换层析进行纯化，最终得到高纯度的尿促性素，其特征在于，该方法包括如下步骤：尿促性素粗品用含NaCl、EDTA的Tris-HCl缓冲液溶解，离心去沉淀，得上清液；亲和层析：用含NaCl的Tris-HCl平衡液平衡Argmatin-Sepharose柱，上清液上柱后，用含NaCl、盐酸胍的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液经超滤脱盐至无氯离子；（3）离子交换层析：将上述超滤脱盐后的溶液加NaCl和1mol/LTris-HCl稀释至一定浓度，上样于DEAE-SepharoseFastFlow柱，用含NaCl的Tris-HCl平衡液冲洗，换用含不同浓度NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱；紫外检测，收集酶活性部分，超滤浓缩后冷冻干燥，即得成品。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的缓冲液是pH6.0~8.0的含0.1~0.3m...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘乃山，夏衬来，于晓娜，
申请(专利权)人：青岛康原药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37