含有一个或几个点突变的青霉素G酰化酶制造技术

本发明专利技术涉及新的青霉素G酰化酶突变体，编码所述突变体的核酸，相关表达载体和宿主细胞以及所述突变体合成阿莫西林的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物生产领域，具体涉及β-内酰胺类抗生素生产及其生产用酶，更具体涉及青霉素G酰化酶及其在β-内酰胺类抗生素生产中的应用。
技术介绍
β -内酰胺类抗生素是临床应用中最重要的一大类抗生素(包括青霉素和头孢菌素等)，其分子中所含的青霉烷或头孢烯能够破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用。天然存在的β_内酰胺类抗生素具有抗菌谱窄、不耐酸、容易产生抗药性和容易引起过敏反应等缺点，这些缺点促使了半合成青霉素和半合成头孢菌素的研发。青霉素G 酰化酶(penicillin G acylase, PGA, EC 3.5.1.11))可以水解青霉素G(penicillinG，PenG)获得β -内酰胺抗生素工业中的重要中间体6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanic acid, 6-ΑΡΑ),同时又可以6-ΑΡΑ为原料合成其他多种合成或半合成β -内酰胺类抗生素。因此，PGA是β -内酰胺类抗生素工业中一种具有重要意义的生物催化剂。由于PGA的开发具有诱人前景，许多科研院所及制药企业投入大量的研究，并有大量研究文献与专利相继报道。目前已经从许多细菌中克隆并表达出编码PGA的基因，如大肠杆菌(Escherichia co7i,Ec)、嗜朽1 檬酸克吕沃尔氏菌{Kluyvera citrophila’lc)、電氏普罗威登斯菌{Providencia reiigeri, Pr)、幾产喊杆菌(Alcaligenes faecal is, Af) >无色杆菌木糖氧化属 iAchromobacter xylosoxidans, Αχ)、假单胞菌属(Pseudomorms sp,Ps)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium, Bm)与粘节杆菌 iArthrobacterviscosus，Av)坐寸ο周政(ActaBiochemica et Biophysica, 35 (6):573_579)、程天凡(2005,浙江大学硕士学位论文)等利用PGA基因家族重排技术对PGA基因进行改造，分别获得了合成活性提高的重组体和合成/水解比率提高的重组体；Alkema等(Alkema WBL, 2002，Eur.J.Biochem，269:2093-2100)将a F146和β F24氨基酸残基分别突变为亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)后，氨苄青霉素和头孢氨苄的合成性能得到提高。此外，国际专利申请W096/05318通过突变底物结合位点的一个或多个氨基酸来改变PGA的特异性及合成/水解比率；W098/20210报道了 EcPGA的α 142和α 146位氨基酸的突变和β24、β56或β 177位氨基酸的突变，特别是突变体i3F 24A突变体合成青霉素和头孢菌素的产量具有显著提高；而在W003/055998中，突变体a R145L、a R145C、a R145K虽然具有较高的合成/水解比 率，但合成活性却大大降低，中国专利CN101177688所报道的BmPGA的突变体也显示了相似的结果。虽然研究人员已经分离纯化并克隆表达出许多天然存在的PGA并进行改造，但这些PGA仍有很多方面不尽如人意，如成熟为活性酶的效率不高、合成活性低或合成/水解(S/Η)比率低、生成的副产物多等不足。因此本领域存在对具有合成/水解比率高、合成活性高和副产物少的青霉素G酰化酶的需要。
技术实现思路
本专利技术涉及新的青霉素G酰化酶突变体，编码所述突变体的核酸，相关表达载体和宿主细胞以及所述突变体合成阿莫西林的用途。本专利技术的青霉素G酰化酶突变体的合成活性和合成/水解比率相比野生型有了较大的提高，副产物降低，原料利用率有了很大提升，降低了成本，减少了能耗和环境污染。本专利技术还构建了青霉素G酰化酶突变体的四倍体表达盒重组菌，使产酶量显著提高，成本大大降低，节约了发酵产酶环节的原料、人员及时间成本。在一个实施方案中，本专利技术提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌{Escherichia coli )ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、PD334E 中的任意一至八个氨基酸突变。在一个实施方案中，本专利技术提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a NI IOQ氨基酸突变，以及选自 a D154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本专利技术提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a D154E氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本专利技术提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野 生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a N176Q氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本专利技术提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含a Q204N氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本专利技术提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含β E85D氨基酸突变，以及选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β K95R、β Q233N、PD334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本专利技术提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含β K95R氨基酸突变，以及选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β E85D, β Q233N、PD334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本专利技术提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含β Q233N氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。在一个实施方案中，本专利技术提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌ATCCl 1105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体在SEQ?ID?NO.1的埃希氏大肠杆菌（Escherichia?coli）ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含选自αN110Q、αD154E、αN176Q、αQ204N、βE85D、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至八个氨基酸突变。

【技术特征摘要】
1.一种青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体在SEQ ID N0.1的埃希氏大肠杆菌(Mscherichia coli )ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含选自aNllOQ、aD154E、a N176Q、a Q204N、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至八个氨基酸突变。2.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N氨基酸突变，以及选自 aNllOQ、aD154E、a N176Q、β E85D、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至七个氨基酸突变。3.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N、β E85D 氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至六个氨基酸突变。4.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N、β K95R 氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β E85D、β Q233N、β D334E 中的任意一至六个氨基酸突变。5.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aNllOQ、a Q204N、β E85D 氨基酸突变，以及选自 a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至五个氨基酸突变。6.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aD154E、a Q204N、β E85D 氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a N176Q、β K95R、β Q233N、β D334E 中的任意一至五个氨基酸突变。7.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N、3E85D、PQ233N 氨基酸突 变，以及选自 aNllOQ、a D154E、a N176Q、β K95R、β D334E 中的任意一至五个氨基酸突变。8.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于,所述突变体包含aQ204N、β E85D、β D334E 氨基酸突变，以及选自 a NI 10Q、a D154E、a N176Q、β K95R、β Q233N 中的任意一至五个氨基酸突变。9.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体包含aNllOQ、a Q204N、β K95R 氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：余允东，王晓霞，祝俊，杨晓鹏，吴清云，吴会广，马春艳，
申请(专利权)人：石药集团中奇制药技术石家庄有限公司，
类型：发明
国别省市：