一种制备和回收７－氨基去乙酸头孢烷酸（７－ＡＤＣＡ）的方法，包括： ａ）在真菌表达信号的转录和翻译调控下，用扩环酶基因对产黄青霉进行转化； ｂ）将上述菌株在适于产生青霉素Ｇ的培养基中发酵，并在所述培养基中加入苯乙酸或其盐或其酯，青霉素Ｇ经扩环形成苯乙酰基－７－ＡＤＣＡ； ｃ）从发酵液中回收苯乙酰基－７－ＡＤＣＡ； ｄ）将苯乙酰基－７－ＡＤＣＡ脱酰基化；并且 ｅ）回收结晶的７－ＡＤＣＡ。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及制备和回收7-氨基去乙酸头孢烷酸(7-ADCA)的生物合成方法。β-内酰胺抗生素构成最重要的一类抗生素化合物，并具有悠久的临床应用史。这类抗生素中，突出的有青霉素类和头孢菌素类。这些化合物分别由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和产黄枝顶孢(Acremonium chrysogenum)天然产生。经过经典的菌种改进技术，使产黄青霉和产黄枝顶孢的抗生素生产水平比过去几十年大大提高了。随着对产生青霉素和头孢菌素的生物合成途径的了解增多和重组DNA技术的出现，现在有了改进生产菌株和将这些化合物体内衍生化的新工具。β-内酰胺生物合成中涉及的大部分酶已得以鉴定，对其相应基因已进行了克隆，如见Ingolia和Queener的Med.Res.Rev.9(1989)，245-246(生物合成途径和酶)，及Aharonowitz，Cohen，和Martin的Ann.Rev.Microbiol.46(1992)，461-495(基因克隆)。产黄青霉中青霉素生物合成的头两步是三种氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)缩合成三肽LLD-ACV，然后该三肽环化成异青霉素N。该化合物含有典型的β-内酰胺结构。第三步涉及通过酰基转移酶(AT)的作用以疏水侧链交换L-5-氨基-5-羧基戊酸的亲水侧链。如EP-A-0448180中所述，由AT介导的酶促交换反应发生在一种细胞器-微体中。头孢菌素比青霉素贵得多。一个原因是一些头孢菌素(如cephalexin)是由青霉素经若干步化学转化而制得的。另一个原因是迄今只能发酵出具有D-5-氨基-5-羧基戊酰侧链的头孢菌素。在此方面迄今最重要的起始物头孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，这就意味着使用麻烦而又昂贵的柱技术进行费时费钱的分离工艺。这样获得的头孢菌素C须经若干化学和酶促转化才能转变为治疗用头孢菌素。使用复杂的化学步骤使青霉素G发生扩环和衍生是目前工业上制备中间体7-ADCA的流行方法。生产7-ADCA所需的一个化学步骤5-元青霉素环结构扩环成为6-元的头孢菌素环结构(参见US4,003,894)。但这种复杂的化学步骤既昂贵又对环境有害。所以目前急需用如发酵过程中的酶催化这类酶促反应取代化学方法。而用生物方法取代化学扩环方法的关键是头孢菌素生物合成途径中的中心酶-去乙酸头孢菌素C合成酶或扩环酶。在一些实例中，人们发现来自细菌带棒链霉菌(Streptomycesclavuligerus)的扩环酶可在体外使青霉素环结构扩环(Baldwin等，四面体43(13)，3009，(1987))。在Cantwell等人的文章中(现代遗传学(Current Genetics)，17，213-221(1990))，描述了在产黄青霉中表达带棒链霉菌扩环酶。如该文中所示，在发酵过程中表达扩环酶并没有形成头孢菌素。又如Cantwell等人在Proc.R.Soc.Lond.B.248(1992)，283-289中所描述，只有当扩环酶和带棒链霉菌异青霉素N异构酶基因一起引入产黄青霉，才能观察到青霉素N(它的天然底物)的青霉素环结构转化为去乙酸头孢菌素C(它的天然产物)的头孢菌素环结构。已对扩环酶从生化和功能方面进行了充分表征(EP-A-0366354)，也对其相应的基因进行了表征。已描述了cefE基因的物理图谱(EP-A-0341892)和DNA序列，及cefE在产黄青霉中的转化研究。扩环酶的另一个来源是细菌Nocardia lactamdurans(早期称为Streptomyces lactamdurans)。已描述了酶的生化特征和基因的DNA序列(分别见Cortes等，J.Gen.Microbiol.133(1987)，3165-3174及Coque等，Mol.Gen.Genet.236(1993)，453-458)。既然扩环酶可催化青霉素N的5-元噻唑烷环结构扩环为去乙酸头孢菌素C的6-元二氢噻嗪环结构，这种酶自然成为取代化学方法扩环的合理的候选物。但不幸的是，这种酶只作用于头孢菌素生物合成途径的青霉素N中间体，而不作用于包括青霉素G在内的由产黄青霉产生的廉价易得的青霉素。青霉素N没有商业供应，而且即使经过扩环，青霉素酰基转移酶也不能轻易地将其D-氨基己二酰侧链除去。最近发现扩环酶可将具有特定侧链的青霉素扩环成为相应的7-ADCA衍生物。EP-A-268343描述了使用去乙酸头孢菌素C合成酶对带有3-羧苯基乙酰或己二酰侧链的青霉素进行扩环的体外方法。而且，在EP-A-0532341、EP-A-0540210、WO95/04148及WO95/04149中，扩环酶的这一特性已得到技术开发。在这些专利文件中，由青霉素G经传统的化学转变制备7-ADCA的方法已被含有扩环酶基因的重组产黄青霉株内的特定6-氨基青霉烷酸(6-APA)衍生物的体内转化所替代。更具体地讲，EP-A-052341描述了扩环酶结合5-羧基戊酰侧链作为原料在产黄青霉中的体内应用。5-羧基戊酰是产黄青霉中酰基转移酶的底物。这导致形成5-羧基戊酰-6-青霉烷酸，后者通过引入产黄青霉株中的扩环酶产生5-羧基戊酰-7-ADCA。最后，提到去除5-羧基戊酰侧链生成终产物7-ADCA。在WO95/04148和WO95/4149中，指出3′-羧甲基硫代丙酸和3′3-硫代二丙酸被发现是扩环酶的底物，分别生成2-(羧乙基硫)乙酰-和3-(羧甲基硫)丙酰-7-ADCA。但是，由于青霉素生产菌株具有很高的青霉素G合成能力且提取苯乙酰-7-ADCA的方法更有利，因此，本专利技术具有更多优势。而且，青霉素G的苯乙酰基侧链很容易被产生6-APA的几种微生物的青霉素G酰胺酶(如EP-A-0453047中所指出的分离酶G)催化裂解。各种出版物都报告说扩环酶不能以青霉素G作为底物进行扩环(Baldwin&Abraham(1988)，天然产物报告(Natural Product Reports)，5(2)，p.129-145；Maeda等(1995)，酶和微生物技术(Enzyme andMicrobial Technology)，17，231-234；Crawford等(1995)，生物技术(Bio/technology)，13，p.58-61；Wu-Kuang Yeh等，于“青霉素应用五十年(50 years Penicillin Application)(Kleinkauf和VonDohren编)，209(1991)，特别请见表3A)。但令人惊讶的是，现在发现用扩环酶编码基因转化的产生青霉素G的产黄青霉能够产生苯乙酰-去乙酸头孢烷酸。本专利技术提供一种制备和回收7-氨基去乙酸头孢烷酸(7-ADCA)的方法，包括a)在真菌表达信号的转录和翻译调控下，用扩环酶基因转化产黄青霉菌株；b)在适于产生青霉素G的培养基中发酵所述菌株并在所述培养基中加入苯乙酸或其盐或其酯，青霉素G经扩环形成苯乙酰-7-ADCA；c)从发酵液中回收苯乙酰-7-ADCA；d)将苯乙酰-7-ADCA脱酰基化；及e)回收结晶的7-ADCA。e)步优选为一过滤步骤。优选在低于约4.5的p本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：R·A·L·博温伯格，B·P·克依科曼，D·希泊，A·W·H·瓦利布莱格特，
申请(专利权)人：吉斯特布罗卡迪斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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