一种改进的固定化青霉素G酰基转移酶制造技术

提供了一种具有令人惊奇的良好性能的新固定化青霉素Ｇ酰基转移酶。运用这种固定化酶通过母体氨基β－内酰胺和相应的酰化剂的酶促反应，可以高产率地制备β－内酰胺衍生物。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种改进的固定化青霉素G酰基转移酶。此外，本专利技术涉及运用所说的固定化酶通过母体氨基β-内酰胺核和相应的酰化剂的酶促酰化作用制备β-内酰胺抗生素的方法。
技术介绍
和领域从下列文献已知通过用活化的侧链酸衍生物(例如酰胺或酯)酰化母体氨基β-内酰胺部分酶促制备半合成β-内酰胺抗生素的方法荷兰专利158847、欧洲专利申请339751和473008、国际专利申请WO 92/01061和WO 93/12250、美国专利3816253和西德专利文献2163792和2621618。本领域使用的酶在大多数情况下是来源于大肠杆菌的青霉素酰基转移酶，并且固定化在各种类型的水-不溶性材料上。用于产生阿莫西林、氨苄青霉素、头孢羟氨苄、头孢氨苄和头孢拉定的已知酶促方法的弊端是由于固定化酶的选择性引起的高成本。所说的固定化酶能够缩合活化的侧链衍生物和氨基β-内酰胺，侧链衍生物例如D(-)-苯基甘氨酸酰胺(PGA)、D(-)-苯基甘氨酸甲酯(PGM)、D(-)-4-羟苯基甘氨酸酰胺(HPGA)、D(-)-4-羟苯基甘氨酸甲酯(HPGM)、D(-)-2，5-二氢-苯基甘氨酸酰胺(DPGA)和D(-)-2，5-二氢-苯基甘氨酸甲酯(DPGM)；氨基β-内酰胺例如6-氨基-青霉烷酸、(6-APA)、7-氨基头孢菌酸(7-ACA)、7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸(7-ACCA)、7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸(7-ADCA)和7-氨基-3--3-头孢烯-4-羧酸。另一方面，所说的固定化酶也将活化的侧链衍生物水解成无价值的侧链酸，也将所需产物水解形成侧链酸和母体氨基β-内酰胺，合成和水解之间的高比率会降低活化的侧链衍生物的成本。从国际专利申请WO 93/12250已知，经固定化在Eupergit PCA上的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶的头孢羟氨苄和头孢氨苄合成的合成/水解比率强烈地依赖于反应条件，如pH、反应物浓度和温度。然而没有指出载体材料的性质对合成/水解比率的影响。从欧洲专利222462已知，通过将氨基聚合物(例如藻酸胺、脱乙酰壳多糖果胶或聚乙烯亚胺)添加到载体的基质胶凝成分上，可以把氨基引入到载体材料上。令人惊奇地是，现已发现就活化的侧链衍生物与氨基β-内酰胺的缩合反应中的合成/水解比率而言，在由胶凝剂和包含游离氨基基团的聚合物组成的载体上固定化大肠杆菌青霉素G酰基转移酶使得酶促催化剂与固定在其它载体上的青霉素G酰基转移酶比较具有良好的特性。专利技术概要本专利技术提供了在由胶凝剂和包含游离氨基基团的聚合物组成的载体上固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶。优选地，聚合物选自藻酸胺、脱乙酰壳多糖、果胶或聚乙烯亚胺；更优选地，胶凝剂是明胶。此外，本专利技术提供了通过使用这样的固定化酶经母体氨基β-内酰胺和相应的酰化剂的酶促反应制备β-内酰胺衍生物的改进的方法。特定实施方案可以由本专利技术的方法产生的β-内酰胺衍生物的例子是阿莫西林、氨苄青霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢罗齐、头孢氨苄和头孢拉定。酰基转移酶活性不依赖于头孢烯化合物3-位上的取代基，例如氢、卤素、(低级)烷氧基、甲基或由例如以下基团取代的甲基(低级)烷氧基、(低级)烷酰氧基、卤素、S-R5(其中R5是(低级)烷基、(低级)烷酰基或者取代或未取代的杂环)，N+-R6(其中R6是(低级)烷基或者取代的或未取代的杂环)。低级意指1-6个碳原子。杂环定义为包含至少一个氮、硫或氧原子的不饱和环状结构。酰化剂可以是D(-)-苯基-甘氨酸衍生物、D-(-)-4-羟苯基甘氨酸衍生物或D-2，5-二氢-苯基甘氨酸衍生物，如低级烷基(甲基、乙基、正丙基或异丙基)酯或在-CONH2基团上取代的酰胺。相应的氨基β-内酰胺含有与所制备的β-内酰胺衍生物相同的β-内酰胺核。一般地，本专利技术的方法的反应温度可以在0℃到35℃之间变化。最佳温度取决于在欧洲专利申请473008中提到的底物，在给出的比较实施例中没有最佳化。合适的pH值取决于底物的性质和浓度，典型地在5到9的范围内。为了方便操作，使用pH对照。合适的反应时间从若干分钟到若干小时，特别是从30分钟到3小时。在涉及使用催化剂(例如酶)的商业方法中，在方法的总的经济学上催化剂的价格常常是一个重要的参数。在这样的情况下，催化剂能够再使用而不丧失催化活性是有利的。总之、具有以可再用形式的酶(例如，固定化的或截留形式的)是有利的。研究了以下固定化的大肠杆菌青霉素酰基转移酶A型如国际专利申请WO 92/12782中所描述的方法分离大肠杆菌青霉素酰基转移酶。如欧洲专利申请222462中所描述的方法进行固定化。B型市售的来源于Recordati，意大利的固定化大肠杆菌青霉素G酰基转移酶，如欧洲专利申请473008中所描述的。C型市售的来源于Boehringer Mannheim GmbH，德国的固定化大肠杆菌青霉素G酰基转移酶，称为Enzygel。合适的酶浓度可以从0.1U·ml-1到100U·ml-1(1U＝一个单位酶活性，参见以下)。使用按照本专利技术的方法，可以获得特别高的合成/水解比率。定义和分析方法酶活性就青霉素G酰基转移酶活性的限定而言，使用了以下定义一个单位(U)相当于在标准条件(100g.l-1青霉素G钾盐，0.05M磷酸钾缓冲液，pH8.0，28℃)下每分钟水解1μmole青霉素G的酶量。HPLC分析方法A(阿莫西林)样品用在2mM磷酸钾缓冲液(pH 5)中的25％乙腈1∶10稀释柱Chromsphere C18，5μm(100×3.0mm) 溶剂在包含0.2％十二烷基硫酸钠的12mM磷酸钾缓冲液(pH2.6)中的25％乙腈流速1ml·分钟-1检测波长214nm保留时间HPG(1.9分钟)；HPGA(3.1分钟)；6-APA(3.4分钟)；阿莫西林(4.8分钟)；HPGM(7.3分钟)方法B(头孢氨苄)样品用在2mM磷酸钾缓冲液中的25％乙腈(pH 5)1∶10稀释柱Chromsphere C18，5μm(100×3.0mm)溶剂在包含0.2％十二烷基硫酸钠的12mM磷酸钾缓冲液(pH 3.1)中的29％乙腈，流速1ml·分钟1检测波长214nm保留时间PG(0.8分钟)；7-ADCA(1.3分钟)；PGA(3.7分钟)；头孢氨苄(6，2分钟)；PGM(7.8分钟)方法C(头孢拉定)样品用在50mM磷酸缓冲液(pH 3.0)中的3％1-丙醇1∶150稀释，柱Nucleosil 120 3 C18(250×4.0mm)溶剂洗脱液A50mM磷酸缓冲液，pH 3.0；洗脱液B50％洗脱液A，50％乙腈梯度0-5分钟100％A；5-10分钟从100％A到70％A；10-18分钟70％A；18-18.1分钟从70％A到100％A。流速1ml·分钟1检测波长220nm保留时间7-ADCA(5.3分钟)；DPG(6.0分钟)；DPGA(9.1分钟)；DPGM(15.9分钟)；头孢拉定(18.5分钟)方法D(头孢克洛)样品用在50mM磷酸缓冲液(pH 3.0)中的3％1-丙醇1∶150稀释，柱Nucleosil 120 3 C18(250×4.0mm)溶剂洗脱液A50mM磷酸缓冲液，pH 3.0；洗脱液B50％洗脱液A，50％乙腈梯度0-5分钟1本文档来自技高网...

【技术保护点】
在载体上固定化的青霉素Ｇ酰基转移酶，所说的载体包含胶凝剂和含有游离氨基基团的聚合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：E德弗鲁姆，
申请(专利权)人：吉斯特布罗卡迪斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]