一种人IL1RAP特异性CAR及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人IL1RAP特异性CAR及其应用，所述CAR由IL1RAP特异性单链抗体scFV、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链组成，其中scFV包含IL1RAP单克隆抗体McAb重链、轻链的可变区基因片段，共刺激分子为CD137。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下优点：(1)本发明专利技术所述人IL1RAP特异性CAR引入CD137协同共刺激分子，提高了IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力；(2)本发明专利技术所述IL1RAP特异性CAR‑T细胞不仅可以发挥杀伤白血病细胞的作用，而且可在体内形成长寿的抗原特异性记忆T细胞，从而及时清除新生的白血病细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种人IL1RAP特异性CAR及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种嵌合受体，尤其涉及一种人IL1RAP特异性CAR及其应用。
技术介绍
慢性髓系白血病(ChronicMyelogenousLeukemia,CML)是一种发生在多能造血干细胞上的恶性骨髓增生性疾病，约占白血病的20％，以9号和22号染色体易位t(9；22)(q34；q11)形成的费城染色体(Ph)为特征。该易位形成一种新的融合基因BCR-ABL，此基因编码的融合蛋白p210或p190具有激活的酪氨酸激酶活性，导致髓系造血的异常克隆性增殖，是CML发生发展的根本原因，也是治疗CML的重要靶点。以伊马替尼为代表的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor,TKI)，通过抑制BCR-ABL自身磷酸化和底物磷酸化而抑制细胞增殖和诱导凋亡，现已成为CML患者的一线治疗药物。尽管该药具有良好的疗效，但其对静息状态的白血病干细胞(leukemiastemcell,LSC)无效，使患者易产生耐药性及停药后复发，且存在部分患者原发耐药及可继发骨病等重大缺陷，导致其临床应用效果仍不能令人满意。因此，有效清除LSC可能在根本上改变CML的治疗现况，是当前治疗CML亟待解决的问题。LSC自从被发现后就成为研究的热点，人们试图寻找到区分LSC和造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)的表面标志。IL-1受体辅助蛋白(IL-1receptoraccessoryprotein,IL1RAP)是Toll-like受体超家族的一名成员，是IL-1RⅠ的共受体。IL1RAP基因位于人3号染色体q28，位于小鼠的16号染色体，编码570个氨基酸。RNA不同的剪切形式可形成膜型IL1RAP和可溶型IL1RAP两种形式，膜型IL1RAP是IL-1受体复合物的重要组成部分。最近研究表明，IL1RAP蛋白在急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)病人的LSC表面过表达，且IL1RAP表达水平和AML的临床预后密切相关，沉默IL1RAP可降低AML细胞克隆集落形成，促进细胞凋亡。2010年Jaras等研究发现，IL1RAP在CML病人的LSC上表达显著升高，但在CD34+CD38-的正常HSC上无表达或仅低表达。而在几乎所有正常的造血干细胞和成熟的各个细胞亚群上，IL1RAP的表达均为阴性或弱阳性。此外，研究表明胚胎期过度的IL-1/IL-1R1/IL1RAP信号限制HSC向髓系细胞正常分化，阻断IL1RAP则切断白血病细胞对外源和自分泌IL-1的利用，使白血病细胞增殖率、克隆形成率、克隆刺激活性明显下降。综上可见，在CML中IL1RAP是区分LSC和HSC特异的细胞表面标志，能诱导细胞免疫和体液免疫应答。针对IL1RAP设计药物或者疫苗，可避免正常组织损伤或自身免疫病。在白血病的治疗上，应用抗体已很普遍。直接作用于CD20单抗的使用，是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibodydependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)杀伤白血病B淋巴细胞。最新研究表明，用IL1RAP单克隆抗体可特异性识别IL1RAP+的白血病细胞，并能杀伤IL1RAP+的白血病细胞系及CML患者体内的LSC。然而，体液中存在的可溶性IL1RAP与IL1RAP抗体结合，导致IL1RAP抗体浓度降低而达不到治疗效果。应用IL1RAP抗体需要不间断注射治疗，病人依从性较差。此外，抗IL1RAP抗体对机体肿瘤细胞无免疫监视功能，不能及时发现、有效杀伤新产生的LSC。鉴于此，寻求一种以IL1RAP为靶点治疗CML的新策略势在必行。肿瘤的免疫细胞治疗及抗原特异性细胞疫苗的应用，为肿瘤治疗点亮了新的希望。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,CAR)的出现，是人类在与肿瘤斗争中具有里程碑意义的事件。CAR是将抗体对肿瘤抗原的高度亲和性与T淋巴细胞的杀伤作用相结合，利用基因工程技术构建的嵌合型人工T细胞受体。CAR-T细胞包含识别肿瘤相关抗原的单链抗体、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链，可通过非MHC限制性途径直接杀伤肿瘤细胞。目前，针对乳腺癌抗原ERBB2、结直肠癌抗原CEA和卵巢癌抗原FBP的CAR-T细胞疫苗的功能已分别在动物模型中得到证实。人CAR-T细胞疫苗作用的发挥，首次在含有人CD19抗原的Burkitt淋巴瘤模型中得到证实。2011年NEnglJMed杂志报道，采用包含B细胞特异性抗原CD19、共刺激受体CD137和CD3ζ信号区域的CAR，过继输入治疗慢性淋巴细胞白血病患者，已获得持续缓解长达一年以上的良好疗效。另有研究发现，CAR-T细胞输入到慢性淋巴细胞白血病患者体内，不但可以发挥杀伤白血病细胞的作用，而且可在体内形成长寿的抗原特异性记忆T细胞，从而及时清除新生的白血病细胞。因此，IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗不但能避免IL1RAP抗体的应用缺陷，而且具有形成记忆性细胞的特有优势，在CML的治疗中具有广阔的应用前景。该技术采用CD28分子作为CAR共刺激分子，该方法制得的IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率不高，因而降低了其在体内的抗肿瘤能力。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够提高IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力的受体，本专利技术提供了一种人IL1RAP特异性CAR及其应用。技术方案：一种人IL1RAP特异性CAR，所述CAR由IL1RAP特异性单链抗体scFV、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链组成，其中scFV包含IL1RAP单克隆抗体McAb重链、轻链的可变区基因片段，共刺激分子为CD137。所述IL1RAP的全称为IL1受体辅助蛋白(IL-1receptoraccessoryprotein,IL1RAP)；CAR的全称为嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,CAR)。优选的，所述scFV的重链、轻链可变区片段的氨基酸序列为SEQIDNO:1～2，核苷酸序列为SEQIDNO:3～4。优选的，所述IL1RAP特异性CAR的核苷酸序列为SEQIDNO:5。优选的，所述IL1RAP特异性CAR的载体为LV-Lac。优选的，所述IL1RAP特异性CAR的宿主菌为分泌鼠抗人IL1RAPMcAb的杂交瘤细胞株10D8A7。优选的，所述IL1RAP特异性CAR的靶细胞为KU812。上述人IL1RAP特异性CAR在制备IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗中的应用。有益效果：(1)本专利技术所述人IL1RAP特异性CAR引入CD137协同共刺激分子，提高了IL1RAP特异性CAR病毒转染T细胞后T细胞活化率，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力；(2)本专利技术所述IL1RAP特异性CAR-T细胞疫苗不仅可以发挥杀伤白血病细胞的作用，而且可在体内形成长寿的抗原特异性记忆T细胞，从而及时清除新生的白血病细胞。附图说明图1.杂交瘤细胞总RNA及抗人IL1RAP单抗VH、VL片段PCR电泳图A:DNAmarkerMarkerⅢ；B:M,DNAmarker本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人IL1RAP特异性CAR，其特征在于，所述CAR由IL1RAP特异性单链抗体scFV、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链组成，其中scFV包含IL1RAP单克隆抗体McAb重链、轻链的可变区基因片段，共刺激分子为CD137。

【技术特征摘要】
1.一种人IL1RAP特异性CAR，其特征在于，所述CAR由IL1RAP特异性单链抗体scFV、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链组成，其中scFV包含IL1RAP单克隆抗体McAb重链、轻链的可变区基因片段，共刺激分子为CD137。2.根据权利要求1所述的一种人IL1RAP特异性CAR，其特征在于，所述scFV的重链、轻链可变区片段的氨基酸序列为SEQIDNO:1～2，核苷酸序列为SEQIDNO:3～4。3.根据权利要求1所述的一种人IL1RAP特异性CAR，其特征在于，所述IL1RAP特异性CAR的核苷酸序列为...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵恺，徐开林，尹玲玲，袁姝姝，陈翀，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32