本发明专利技术属于生物技术领域，特别涉及一种扇贝物种特异性检测引物及应用。一种扇贝物种特异性检测引物，其序列是：5’-agattcgggtatttggtgc-3’（上游）；5’-cggtaaagtagaaacgggtat-3’（下游）。一种扇贝物种特异性检测引物的应用，采用扇贝物种特异性检测引物PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条129bp大小的特异性电泳条带，从而将扇贝成分进行特异性鉴定。本发明专利技术特异性引物设计合理，用于扇贝物种检测，特异性好，检测灵敏度高，即经过PCR分析，即可将扇贝成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】-种扇贝物种特异性检测引物及应用
本专利技术属于生物
，特别设及。
技术介绍
扇贝是扇贝属的双壳类软体动物的代称，约有400余种。该科的60余种是世界各 地重要的海洋渔业资源之一。壳、肉、珍珠层具有极高的利用价值，是一种适合于人工高密 度养殖的优良贝类，是我国主要海产经济贝类之一。通过形态学特征进行判断是对扇贝识 别的传统方法，但是运些形态学特征的可塑性强，受环境影响大，具有人为的主观倾向性， 且存在丰富的近缘物种，近缘种间的形态差异细微，所W传统的形态学特征识别方法存在 识别困难与识别错误的问题。 采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别方法中最为热口也是发展最快的分子技 术。快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研究对象。扇 贝与其它近源物种的序列相似度在85-94%之间，而CoxI基因序列有较大差异，目前，贝类 动物的分子检测主要集中于运一序列。已发表的检测方法包括普通PCR方法和实时巧光 PCR方法等，运些方法或存在交叉反应，或对设备要求很高，目前尚没有一种简便的PCR方 法可W将扇贝的基因与其它贝类动物基因完全区分。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足问题，提供方 法。本专利技术可W检测出来自动物样品的微量DNA，完全区分扇贝的基因与其它贝类动物基 因，检测灵敏度高，方法快速，易操作。 本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是：一种扇贝物种特异性检测引物，其 特征在于：其序列是： 上游引物：5, -agattcgggtatttggtgc-3，； 下游引物：5, -cggtaaagtagaaacgggtat-3，。 -种所述扇贝物种特异性检测引物的应用，其特征在于：利用所述扇贝物种特异 性检测引物进行扇贝物种PCR特异性检测。[000引进一步地，所述扇贝物种PCR特异性检测方法为：采用扇贝物种特异性检测引物PCR扩增扇贝的CoxI基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条129bp大小的特异性 电泳条带，从而将扇贝成分进行特异性鉴定。 进一步地，所述PCR扩增扇贝的CoxI基因的25μL反应体系如下表1: 表1. PCR扩增扇贝的CoxI基因的反应体系 进一步地，所述PCR扩增扇贝的CoxI基因的反应参数如下表2: 表2. PCR扩增扇贝的CoxI基因的反应参数 本专利技术特异性引物设计合理，用于扇贝物种检测，特异性好，检测灵敏度高。采用 本方法检测扇贝动物成分结果显示，采用扇贝物种特异性检测引物PCR扩增扇贝的CoxI 基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条129bp大小的特异性电泳条带，即可将扇贝 成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。【附图说明】图1为5种引物PCR结果图，图中：M. DL2000marker, 1. P1P2引物扩增结果，2. P3P4 引物扩增结果，3. P5P6引物扩增结果，4. P7P8引物扩增结果，5. P9P10引物扩增结果，6. 阴性对照。 图2为扇贝与其他海洋动物的PCR特异性检测结果图，图中：M. mark, 1.扇贝， 2.扇贝，3.杂色始，4.紫海胆，5.太平洋牡颇，6.魅蝴，7.阴性对照，8.空白对照。 图3为灵敏度分析结果图，图中：M.DL2000marker，l. 0. 1 ng/yL扩增结果，2. 0. 5ng/yL扩增结果，3. Ing/yL扩增结果，4. 5ng/yL扩增结果，5. lOng/yL扩增结 果，6.阴性对照，7.空白对照。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术进行详细说明，但本专利技术并不局限于具体实施 例。 本实施例中所利用的扇贝物种特异性检测引物，其序列是： 5, -agattcgggtatttggtgc-3，（上游）； 5，一C邑邑t曰曰曰邑t曰邑曰曰曰C邑邑邑t曰t-3，（了贫字）〇 一种所述扇贝物种特异性检测引物的应用，即利用所述扇贝物种特异性检测引物 进行扇贝物种PCR特异性检测，具体步骤如下： 1.扇贝物种特异性检测引物合成：在宝生物公司合成扇贝物种特异性检测引物5对， 其序列(见表3): 表3. PCR扩增扇贝的CoxI基因的引物序列：2.扇贝DM的提取：采用DM提取试剂盒(购于宝生物公司）提取扇贝模板DM,用微 量分光光度计检测提取扇贝模板DNA的浓度为l(K)ng。[001引 3.PCR扩增扇贝的CoxI基因：配制25μLPCR反应体系如下表4 : 表4.PCR扩增扇贝的CoxI基因的反应体系使用该扇贝物种特异性检测引物时设置PCR的反应参数如下表5 : 表5.PCR扩增扇贝的CoxI基因的反应参数4.琼脂糖凝胶电泳检测：^?1?2，？3?4、？5?6、？7?8、？9?10等5对特异性引物口0? 扩增扇贝的CoxI基因后，W2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示巧日图1所示)，经琼脂 糖凝胶电泳检测后会分别产生129bp、278bp、128bp、41化9、357bp大小的特异性电泳条带。 WP1P2作为上下游引物进行特异性PCR扩增，电泳效果最好，PCR扩增效率最高，因此选取 P1P2作为扩增体系的特异性扩增引物。 利用所述扇贝物种特异性检测引物进行扇贝的物种成分实时检测时，采用本方法 检测扇贝动物成分结果显示，采用扇贝物种特异性检测引物PCR扩增检测扇贝、杂色始、紫 海胆、太平洋牡颇、魅蝴等样品，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，扇贝样品产生 一条129bp大小的特异性电泳条带，其他样品无电泳条带，即可将扇贝成分进行准确鉴定， 具有很好的特异性。 采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所 提取的模板DNA梯度稀释，制备成 0. 1ng/yL0. 5ng/yL1ng/yL5ng/yL10ng/ μL5个浓度梯度样品，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行PCR扩增，后W2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，W确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图3所示，所产生 的大小为129bp的特异性电泳条带即为扇贝，当DNA浓度>Ing/μL时均可W特异扩增，即 该标准方法的检测灵敏度为Ing/μL。此方法可W准确的对扇贝的成分进行鉴定，具有很好 的灵敏度。W上内容是结合优选技术方案对本专利技术所做的进一步详细说明，不能认定专利技术的 具体实施仅限于运些说明。对本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术 的构思的前提下，还可W做出简单的推演及替换，都应当视为本专利技术的保护范围。【主权项】1. 一种扇贝物种特异性检测引物，其特征在于：其序列是： 上游引物：5' -agattcgggtatttggtgc-3' ； 下游引物：5' -cggtaaagtagaaacgggtat_3'〇2. -种根据权利要求1所述的扇贝物种特异性检测引物的应用，其特征在于：利用所 述扇贝物种特异性检测引物进行扇贝物种PCR特异性检测。3. 根据权利要求2所述的扇贝物种特异性检测引物的应用，其特征在于：所述扇贝物 种PCR特异性检测方法为：采用扇贝物种特异性检测引物PCR扩增扇贝的CoxI基因，PCR 扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条129bp大小的特异性电泳条带，从而将扇贝成分进行 特异性鉴定。4. 根据权利要求3所述的扇贝物种特异本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种扇贝物种特异性检测引物，其特征在于：其序列是：上游引物：5’‑agattcgggtatttggtgc‑3’；下游引物：5’‑cggtaaagtagaaacgggtat‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：万超，刘淑艳，徐凤敏，宋大贺，
申请(专利权)人：万超，刘淑艳，徐凤敏，宋大贺，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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