一种水稻胚乳特异性启动子制造技术

本发明专利技术提供了一种编码水稻胶乳蛋白的基因，命名为水稻latex1基因，具有如SEQIDNO.2所示的DNA序列，以及来源于该水稻latex1基因上游序列的水稻胚乳特异性启动子，命名为Oslatex1-P启动子。本发明专利技术通过转基因水稻分析的实验证实Oslatex1-P启动子可控制目的基因特异性地在水稻的胚乳组织中表达，在其它组织部位则基本不表达。本发明专利技术提供的Oslatex1-P启动子可用于基因工程改良稻米胚乳相关性状。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物信息学、生物技术和植物基因工程领域。具体地说，本专利技术提供了一种水稻胚乳特异性启动子。
技术介绍
水稻是我国最重要的粮食作物，人们日常食用的大米(加工后的精米)即为水稻的胚乳，胚乳的形成和发育直接影响着水稻的产量和品质，同时胚乳也是一个优良的重组蛋白表达系统。通过生物技术和基因工程策略可以提高种子中稀有蛋白质、维生素和必需氨基酸的含量，提高稻米的营养价值和改善稻米的品质，从而培育出品质更加优良的稻米。如何实现外源基因在转基因水稻中定点、定时、高效表达一直是转基因育种工作者追求的目标。选用具有组织特异性、表达水平高的启动子是实现外源基因在转基因植物特定组织中高效表达的关键。目前，国内外针对组织特异性启动子的研究已获得一些理想的启动子，但这类启动子的数量依然有限，尚不能满足植物基因工程多方面应用的需求。随着基因组学的发展，应用生物信息学的研究方法分析生物信息化数据，利用水稻数据库提供的功能基因的注释和表达模式的相关信息，查询并筛选出水稻不同组织中特异性表达的功能基因以及一些对生长代谢调控起关键作用的基因，进一步设计实验进行基因表达模式验证和调控机理分析，将是一条高效的筛选组织特异性表达启动子的新途径。筛选和分离一些具有组织专一性、高表达水平的启动子以及分析有关的重要特异性调控元件功能，在基因工程研究中有着广泛的用途。胚乳是粮食作物营养的最重要组成部分，因此分离胚乳特异性强表达启动子对植物品质的改良具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种水稻胚乳特异性启动子。该启动子具有启动目的基因在转基因作物的胚乳中特异性表达的功能。本专利技术所提供的水稻胚乳特异性启动子，为下述DNA序列之一(1)具有SEQID NO. 1所示的DNA序列；(2)与SEQID NO. 1有80 %以上同源性，且能够控制目的基因在植物胚乳中特异性表达的DNA序列；(3)在高严谨条件下可以与SEQID NO. 1所示的DNA序列杂交，且能控制目的基因在植物胚乳中特异性表达的DNA序列；(4)在SEQID NO. 1所示的序列基础上进行5，端和3，端分段缺失的DNA序列；(5)在SEQID NO. 1所示的序列基础上进行单核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替换所产生的DNA序列。将具有SEQ ID NO. 1所示DNA序列的水稻hieW基因启动子命名为floated-凡上述高严谨条件可为在0. IX SSC或0. 1 XSSPE,0. 1% SDS溶液，65°C下进行杂交。本专利技术的水稻胚乳特异性启动子来源于水稻Iatexl基因的上游序列，所述水稻 Iatexl基因，具有如SEQ ID N0. 2所示的DNA序列。本专利技术的还提供了一种从水稻中克隆胚乳特异性启动子的方法。该方法首先通过解读生物信息学数据库和水稻功能基因组数据库，从中筛选在胚乳特异性表达的候选基因；然后通过半定量RT-PCR鉴定候选基因时空表达，确定候选基因在胚乳特异性表达的行为；最后通过PCR扩增，克隆胚乳特异性表达基因的上游启动子片段，并通过DNA重组构建胚乳特异性启动子的表达载体，培育转基因植物进行启动子的功能验证。本专利技术通过转基因水稻分析的实验证实Ashi^ri+启动子可控制目的基因特异性地在水稻的胚乳组织中表达，在其它组织部位则基本不表达。本专利技术提供的Oslatexl-P 启动子可用于基因工程改良稻米胚乳相关性状。附图说明图1，水稻植株中基因的表达模式，通过半定量RT-PCR分析，以Actin作为内参基因；其中，R，根；S，茎；L，叶；Ε，胚；ΕΝ1，胚乳(DAF15);EN2，成熟胚乳(DAF25);DAF (Day After Flower)指开花后天数；CK为阴性对照。图2，Real-time PCR分析10个胚乳基因在水稻胚乳发育不同时期的差异表达； 其中，DAF指开花后天数；横坐标上DAF5、DAFlO, DAF25分别代表开花后5、10、25天的胚乳；柱形图上方阿拉伯数字表示不同的水稻基因，I, GluDl ；2，GluC-, ,, GluB4 ；4，GluBl ；5， GluA2 ^,Prolamin-13 ；7, SS~1 ；8, Latex-I ·’％Ρ450_1 -,\^)，LTPL29。图3，Iatexl基因的定时定量表达与水稻胚乳灌浆速率的内在关联；其中，A为 Iatexl基因在水稻种子胚乳灌浆过程中定时定量表达水平的测定；B为水稻胚乳灌浆速率的测定；横坐标上 DAF1-2、DAF3、DAF5、DAF10、DAF15、DAF20、DAF25 分别代表开花后 1_2、3、 5、10、15、20、25 天的胚乳。图4，pCXGUS-P-latexl植物表达载体构建示意图；其中，A为T-DNA的结构示意图；B为pCXGUS-P-latexl表达载体图谱。图5，转pCXGUS-P-latexl载体的水稻TO代植株⑶S组织化学染色图；其中，A为转基因植株的⑶S组织化学染色图，1-5分别为转基因植株根、茎、叶、颖花、种子；B为非转基因植株的⑶S组织化学染色图，6-10分别为非转基因植株根、茎、叶、颖花、种子。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。以下实施例用于说明本专利技术而不限制本专利技术的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1通过数据库检索筛选水稻胚乳特异性表达候选基因已有的研究表明，胚乳特异性表达基因主要集中在种子贮藏蛋白类基因、淀粉合成调控相关的酶基因、种子过敏蛋白及生理代谢调控相关基因等。通过综合查询几个主要的植物及水稻基因组数据库 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)、EMBL (http://www. ebi. ac.uk/emb1)>Gramene (http://www. gramene. org)禾口 RAP—DB (http://rapdb. dna. affrc. go. jp)，选择了 50个水稻种子发育相关的基因，包括种子贮藏蛋白基因、淀粉合成酶基因、 种子代谢调控相关基因等。进一步参考种子基因表达数据库kedGeneDB (http//sgdb. cbi. pku. edu. cn)，选择在表达谱分析中只在胚乳组织表达，而在其它组织部位基本不表达的基因，确定了其中之一的编码水稻胶乳蛋白的基因0s06g0528300作为胚乳特异性表达的基因，命名为水稻基因，具有如SEQ ID NO. 2所示的DNA序列。实施例2水稻不同组织总RNA的提取用TRNzol Total RNA Reagent试剂盒(TIANGEN生物技术公司)分别提取粳稻日本晴根、茎、叶、颖花、种子、开花授粉后10天、25天的胚和胚乳的总RNA，具体的实验步骤参照试剂盒说明书。为了去除总RNA中可能存在的基因组DNA的污染，对所提取的总RNA全部进行DNaseI (TAKARA公司)消化处理。经DNaseI (RNA-free) 37 °C处理Ih后，重复RNA 的抽提操作以获得高纯度总RNA。然后再用i^rmentaS#K1622试剂盒(Fermentas公司)对所提取的总RNA进行反转录(RT)，获得cDNA第一链，用于RT-PCR实验。半定量RT-PCR鉴定特异基本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种编码水稻胶乳蛋白的基因，命名为水稻ｌａｔｅｘ１基因，具有如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２所示的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王锋，周云，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：35